Summary
Dette arbejde beskriver brugen af en flotationsmetode til at identificere Toxocara canis og Ancylostoma spp. påvist i fækale prøver indsamlet fra hunde i Mexico fra 2017 til 2021 under feltbetingelser.
Abstract
Diagnosticering af hundeparasitter med zoonotisk potentiale såsom Toxocara canis og Ancylostoma caninum under feltforhold er normalt vanskelig på grund af begrænset adgang til et laboratorium i landdistrikter og forstæder i Mexico. Denne undersøgelse havde til formål at påvise T. canis og Ancylostoma spp. i fækale prøver indsamlet fra hunde i Mexico fra 2017 til 2021 under feltbetingelser. Beregning af stikprøvestørrelse resulterede i en måltilmelding på 534 hunde over hele landet.
Prøver blev indsamlet direkte fra endetarmen eller jorden efter afføring. Prøverne blev opbevaret i individuelle, tæt forseglede plastposer ved 4 °C. En mættet opløsning af natriumchlorid (vægtfylde [SpG] 1,20) blev fremstillet både under felt- og laboratoriebetingelser. Inden for 3 dage efter indsamling blev 2-4 g afføring testet for parasitter ved anvendelse af en flotationsmetode ved at suspendere hver fækalprøve i en saltopløsning. Afføring blev blandet med flotationsopløsningen og knust ved hjælp af en metalsked.
Når der var opnået en ensartet konsistens, blev fækalprøven hældt i en ny plastikkop ved hjælp af en sigte og fik lov til at sidde i 10-15 minutter. Tre dråber fra toppen af blandingen blev opsamlet under anvendelse af en steriliseret inokulationssløjfe. Lysbillederne blev placeret på mikroskopet, og parasitter blev identificeret af uddannede parasitologer. Fækale prøver fra 1.055 hunde blev screenet mikroskopisk. Antallet af positive prøver for Ancylostoma spp. var 833 (78,95 % hyppighed) og 222 (21,04 %) for T. canis. Disse resultater illustrerer vigtigheden af at identificere zoonotiske helminths hos hunde, der bor i by- og landdistrikter i Mexico ved hjælp af en coproparasitoskopisk teknik i laboratoriet og under feltforhold.
Introduction
Gastrointestinale parasitter er et af de mest almindelige sundhedsproblemer, der påvirker hunde1. Estimater tyder på, at der er ~ 700 millioner husdyr over hele verden, og ca. 175 millioner kan kategoriseres som fritgående2. Mere end 60 parasitarter deles mellem hunde og mennesker, hvilket tyder på, at hunde kan være en kilde til infektion for mennesker med disse parasitter3. Toxocara canis og Ancylostoma caninum er to parasitære arter, der inficerer hunde og ved et uheld menneskelige værter. I øjeblikket er der flere undersøgelser om de steder, hvor disse helminths er i stand til at overleve og reproducere i Mexico. Forekomsten af Toxocara hos hunde varierer fra 0% til over 87% i USA, Mexico, Mellemamerika og Caribien4. Toxocara canis og Ancylostoma spp. samt andre parasitære arter hos hunde er tidligere rapporteret i Mexico 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (tabel 1).
| Parasitære arter | Region | Udbredelse (%) | Henvisning |
| Ancylostoma caninum | Querétaro | 42.90 | 5 |
| Tabasco | 15.90 | 6 | |
| Campeche | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| Yucatán | 73.8 | 8 | |
| Babesia | Morelos | 13.60 | 9 |
| Veracruz | 10.00 | ||
| Coccidial oocyster | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Ctenocephalider | Morelos | 30.3 | 10 |
| Dipylidium caninum | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Dirofilaria | Yucatán | 7.0 – 8.3 | 11 |
| Giardia | Tabasco | 3.00 | 6 |
| Yucatán | 18.8 | 8 | |
| Leishmania | Chiapas | 19.00 | 12 |
| Bændelorm | Baja Californien | 6.79 | 13 |
| Toxocara canis | Querétaro | 22.10 | 5 |
| Yucatán | 6.20 | 8 | |
| Trichuris vulpis | Yucatán | 25.40 | 8 |
| Trypanosoma | Jalisco | 8.10 | 9 |
| Campeche | 7.60 | ||
| Chiapas | 4.5 – 42.8 | ||
| Quintana Roo | 20.1 – 21.3 | ||
| Toluca | 17.50 | ||
| Yucatán | 9.8 – 34 |
Tabel 1: Regional forekomst (%) af hundeparasitter i Mexico fra 2001 til 2020. Resultater fra tidligere undersøgelser udført fra 2001 til 2020 har gjort det muligt at identificere distribution af hundeparasitter på tværs af flere by- og landområder i Mexico. Disse undersøgelser giver en dyb forståelse af epidemiologiske elementer, der bidrager til hundeparasitters persistens i forskellige økosystemer, hvilket bidrager til en omfattende vurdering af visse parasitarters zoonotiske virkninger.
Livscyklusstadier af tarmparasitter, såsom æg, cyster, oocyster eller larver kan findes i afføringsprøver. Således giver undersøgelse af fækalt materiale værdifuld information om dyrets parasitter. Behovet for en metode til påvisning af Ancylostomidae-æg i menneskelig afføring førte til brugen af det enkle fækale smear i 1878, som blev brugt i mange år til at detektere gastrointestinale parasitter, men blev anset for ikke særlig følsomme. Således opstod behovet for at udvikle bedre copromikroskopiske metoder14. Mere end 100 år er gået siden flotationsteknikken til genopretning og tælling af parasitæg i fækale prøver først blev beskrevet15. Siden da er flere metoder og varianter af flotationsteknikken blevet betragtet som en standard til påvisning af nogle parasitter i deres værter.
For eksempel beskrev Lane en metode i 1924, der involverede den direkte centrifugale flotationsteknik, som integrerer centrifugering efterfulgt af flydende sedimentet i en mættet natriumchloridopløsning med SpG 1,2 i 1 g (Lane) eller 10 g (Stolls modifikation). Flotationsteknikken blev efterfølgende modificeret ved anvendelse af opløsninger med forskellige SpG14. I 1939 rapporterede Gordon og Whitlock ulemperne ved Stolls teknik på grund af interferens fra detritus i visualisering af parasitæg og udviklede den kvantitative metode kendt som McMaster16. I 1979 demonstrerede O'Grady og Slocombe, at den specifikke tyngdekraft af opløsningen, timingen og maskestørrelserne af sier påvirker nøjagtigheden af ægdetektion ved hjælp af flotationsteknikken17. I løbet af de sidste årtier, fordi der er foretaget flere ændringer i flotationsteknikken, er der et presserende behov for standardisering af flotationsmetoder. På nuværende tidspunkt er påvisning af helminthinfektioner hos hunde i forbindelse med forebyggelse af zoonotiske parasitter påkrævet for at anvende passende anthelmintiske behandlinger for at begrænse miljøforurening med infektiøse stadier af zoonotiske nematoder18.
Blandt kvalitative metoder anvendes fækal flotationsteknik i vid udstrækning og accepteres, fordi den ikke kræver meget udstyr, er enkel, billig og reproducerbar; Alligevel har det en stor ulempe, fordi det mangler følsomhed, når infektionens intensitet er lav19. Evnen til at afsløre tilstedeværelsen af et større antal parasitære elementer såsom æg, oocyster, cyster eller nematodelarver bestemmes normalt af opløsningens tæthed20.
Tidligere rapporter har sammenlignet coproparasitologiske teknikker til påvisning af hunde nematodeæg. Med hensyn til påvisning af bevægelige protozoer anvendes direkte fækale udstrygninger; der henviser til, at sedimenteringsmetoder er nyttige til diagnosticering af tunge æg af parasitter såsom trematoder21. En af de mest anvendte feltbaserede diagnostiske tests er fækal smear-metoden. Det lave følsomhedsniveau af denne teknik kan imidlertid tilskrives det faktum, at det indeholder affald, der forstyrrer påvisningen af parasitæg. Ved at inkorporere et sigtetrin sammen med løsninger, der giver den korrekte SpG, flotationsmetoden giver en klarere og mindre rodet observation af ascarid og hageormæg. Dette fører til en mere præcis og effektiv proces for mikroskopisk screening22. Ligeledes anvendes simpel flotation og direkte centrifugalflotationsteknikker meget almindeligt til at genvinde parasitæg og oocyster14. De klassiske flotationsmetoder kan betragtes som kvalitative eller kvantitative afhængigt af brugen af et tællekammer som McMaster-metoden15. Da flotationsteknikken imidlertid har lav følsomhed og fokuserer på påvisning af parasitter i patentperioden, bør negative resultater ikke betragtes som afgørende. Nøjagtigheden afhænger imidlertid ikke kun af bevaringsproceduren for fækale prøver eller SpG af flotationsopløsninger, men afhænger også af den tekniske færdighed og erfaring med at udføre fækale undersøgelser af brugeren.
Derfor er andre metoder blevet undersøgt til påvisning af hundeparasitter i afføring. Det er almindeligt anerkendt, at en af de mest anvendte tilgange til diagnosticering af intestinale helminthinfektioner hos hunde er FLOTAC-teknikken, en multivalent, følsom og nøjagtig metode, der giver nøjagtige og pålidelige resultater til diagnosticering af A. caninum hos hunde sammenlignet med en flotationsprotokol i et rør og McMaster-teknikken19, 23. Sedimenteringsmetoder er nyttige til genopretning af flukeæg, embryonerede nematodeæg og de fleste bændelormæg, som ikke kan genvindes på overfladen af en flotationsopløsning, fordi disse strukturer ikke flyder24. En metode, der har vist sig at være bedre end flotation / sedimenteringsteknikker, er den modificerede dobbeltcentrifugale flotationsmetode, da den muliggør påvisning af cestodeæg i afføring, er mindre tidskrævende, adskiller Anoplocephala-æg fra fækal affald og reducerer krystallisering25. Desuden er denne teknik med succes blevet anvendt til at detektere ascaridæg med høj følsomhed26. Alligevel kræver nogle af disse førnævnte teknikker og centrifugalmetoder såsom Ovassay, i modsætning til flotationsprotokollen, vi foreslår i denne undersøgelse, prøvekonservering i reagenser såsom formalin, kommercielle sæt, prøvebehandling under laboratoriebetingelser og anvendelse af reagenser såsom zinksulfat27, som er dyre og kræver særlige bortskaffelsesprocedurer for at undgå miljøtoksicitet.
Anvendelsen af teknikker, der øger flotationsmetodens følsomhed ved at tilføje løsninger med høj SpG, er blevet foretrukket for nylig. Det må imidlertid overvejes, at ulempen ved disse opløsninger er stigningen i affald i det endelige præparat og dermed den unøjagtige påvisning af parasitæg. Derudover påvirker den kommercielle tilgængelighed af materialer, reagenser, omkostninger, miljøpåvirkningsproblemer og vanskeligheder ved brug af centrifugalmetoder valget af en flotationsteknik14, hvilket kan være udfordrende under feltforhold i modsætning til den protokol, vi præsenterer i dette arbejde. Fremstillingen af flotationsopløsningerne med bordsalt er fordelagtig i forhold til udnyttelsen af sukker, fordi sukker under markforhold tiltrækker insekter som hvepse og bier, og præparaterne bliver klæbrige. Endvidere er opløsninger som phenol, der tilsættes sukkeropløsninger for at undgå klæbrighed, ellerZnSO4komplekse at kassere korrekt i henhold til miljøbeskyttelsesretningslinjer og kan ikke bortskaffes i marken; i modsætning til en bordsaltopløsning.
Målet med dette manuskript er at demonstrere trinene til påvisning af T. canis og Ancylostoma spp. æg i fækale prøver ved hjælp af en tilpasning af den enkle flotationsteknik under felt- og laboratorieforhold. I overensstemmelse med den hermed beskrevne protokol og ved hjælp af et mikroskop med et backupbatteri er diagnosen af disse hunde zoonotiske parasitter i landdistrikter og forstæder mulig, når der ikke er laboratorieudstyr og infrastruktur til rådighed. Den enkle flotationsmetode, der er beskrevet i dette arbejde, kan give hurtige resultater og er en ikke-invasiv og omkostningseffektiv teknik til rutinemæssig screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brug og pleje af hunde blev godkendt af det nationale og autonome universitet i Mexico.
1. Indsamling af fækale prøver
BEMÆRK: Håndter hunden med hjælp fra en dyrlæge eller ejeren af dyret.
- I tilfælde af vildtlevende hunde (figur 1A) eller nervøse dyr indsamles prøver fra jorden lige efter afføring eller højst 10 minutter senere.
- Smør kirurgiske handsker eller tyndvæggede polyethylenposer med vand eller vaselin. For at indsamle fækale prøver fra endetarmen skal du bære kirurgiske handsker eller tyndvæggede polyethylenposer.
- Saml mindst 2 g afføring fra hver hund (figur 1B).
- Identificer individuelle fækale prøver som følger: dato, placering (Global Positioning System [GPS] koordinater ved hjælp af Google Maps), tildel et identifikationsnummer for hvert dyr, hundens omtrentlige alder, hundens køn, race, indendørs eller udendørs (vildtlevende) hund.
- Luk poserne indeholdende fækalprøven med en stram knude. Opbevar poserne nedkølet (4-8 °C), hvis afføringsprøverne ikke analyseres inden for 3-4 timer efter indsamling.
2. Fremstilling af en mættet saltopløsning til feltdiagnose
BEMÆRK: Hvis adgangen til en vægt, målemateriale, komfurer eller gas til kogning af vand er fraværende eller begrænset, kan den mættede saltopløsning let fremstilles ved hjælp af vand, almindeligt bordsalt, en plastik 12 oz (355 ml) kop og en 1 L sodavand plast tom flaske.
- Vask grundigt en tom 1 L sodavandsflaske. Fyld flasken med 1 liter vand.
- Fyld en 12 oz plastikkop med almindeligt bordsalt.
- Overfør saltet til sodavandsflasken.
- Luk sodavandsflasken tæt med skruelåget. Ryst opløsningen kraftigt, indtil saltet ikke længere opløses.
BEMÆRK: Rystelse af opløsningen i sodavandsflasken indtil fuldstændig opløsning af salt kan tage op til 90 minutter.
3. Fremstilling af en mættet saltopløsning til laboratoriediagnose
- Væg 420 g almindeligt bordsalt.
- Opløs 420 g salt i 1 liter vand.
- Kog opløsningen, indtil der ikke opløses mere salt.
- Opløsningen filtreres for at kassere det uopløste salt.
- Kontroller koncentrationen af opløsningen ved hjælp af et tungt væskehydrometer eller densitetsmeter.
BEMÆRK: Den ideelle koncentration har en SpG på 1,20 for at opnå bedre resultater (figur 2A). Et ægs flydende evne påvirkes af dets interaktion med opløsningen, hvilket bidrager til ægens varierende evne til at flyde i opløsninger med samme specifikke tyngdekraft. For at opnå optimal æggenvinding er det derfor vigtigt at overveje det øvre interval af specifik tyngdekraft i flotationsopløsningen og sikre, at det overgår det for de målrettede parasitelementer6.
4. Flotation metode
BEMÆRK: Hvis fækale prøver er for tørre eller hårde, macereres de i en mørtel.
- Brug en ske til at placere ca. 3 g afføring i en plastikkop (~ 8,5 cm i højden og ~ 5,5 cm i diameter).
- Tilsæt 1 ml mættet saltopløsning, indtil der opnås en pasta.
- Rør rundt i 1 min og tilsæt 100 ml mættet saltopløsning.
- Før denne suspension gennem en plastsi i en anden plastikkop for at undgå grove partikler (figur 2B).
- Lad ophænget stå i 15-20 min.
- Anbring en podningssløjfe i en flamme i 1 s for at sikre, at den er fri for æg, cyster eller oocyster (figur 2C).
- Vent i 5 s på, at podningssløjfen køler af (figur 2D).
- Tag tre dråber fra suspensionens overflade med podningssløjfen. Placer hver af de tre dråber separat på et glasglas (figur 2E-G)
BEMÆRK: Sørg for, at dråberne ikke er i kontakt med hinanden (figur 2H). - Observer under mikroskopet med et 10x mål (figur 2I). Placer en dæksel, hvis forstørrelsen øges til 40x.
- Når der observeres et positivt resultat i dråben, tildeles et kryds (+) i laboratorielogbogen for at registrere tilstedeværelsen af parasitter i patentperioden på tilfældige steder på fækalsuspensionsoverfladen.
5. Fortolkning af flotationsmetoden
BEMÆRK: Negative resultater er ikke entydige.
- Udfør en serie på tre tests med prøver fra 3 på hinanden følgende dage for at øge testens følsomhed.
BEMÆRK: Positive resultater indikerer tilstedeværelsen af parasitter i patentperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbejde beskrives indsamling og coproparasitoskopiske procedurer til identifikation af T. canis og Ancylostoma spp. Begrundelsen bag tilpasningen af den enkle fækale flotationsmetode til påvisning af hundehelminthæg er, at denne teknik er omkostningseffektiv, da løsningerne, udstyret og materialerne er billige. Derfor har metoden en høj prøvehåndteringskapacitet, da flere prøver kan behandles på kort tid. Desuden er den enkle fækale flotationsmetode let at udføre og relativt følsom.
Stikprøvestørrelsen og udvælgelsen af dyr blev foretaget af bekvemmelighed, hovedsageligt bestemt af viljen hos ejeren af dyrene og sikkerheden for vildtlevende hunde, der nærmer sig. I dette arbejde blev flotationsmetoden brugt til at vurdere forekomster og frekvenser af Ancylostoma spp. og T. canis hos hunde Canis lupus familiaris i Mexico i løbet af 4 år startende i 2017. Fækale prøver fra 1.638 hunde blev indsamlet og screenet mikroskopisk. I alt 1.235 hunde var positive for T. canis og Ancylostoma spp. Et af målene med at anvende flotationsmetoden var at demonstrere dens effektivitet til måling af forekomsten af Toxocara eller Ancylostoma, men vi havde også til formål at foretage en dybere undersøgelse af de faktorer, der kunne påvirke deres udbredelse. Derfor blev 185 dyr med blandede infektioner kasseret. Antallet af positive prøver for Ancylostoma spp. var 833 (78,95 % hyppighed) og 222 (21,04 %) for T. canis. Af de 1.050 prøver blev 75,5% (793 prøver) behandlet og læst i felten ved at forberede flotationsopløsningen med en sodavandsflaske og ved hjælp af et mikroskop med 3 x 1,2 V AA genopladelige batterier til 4 timers kontinuerlig drift. De resterende 257 fækale prøver blev undersøgt i laboratoriet.
Et mål med denne undersøgelse var at anvende en flotationsløsning og en metode i en feltindstilling for at fremskynde og lette diagnosen af to helminthparasitter hos hunde i områder, hvor der ikke er laboratorieinfrastruktur eller udstyr til rådighed. Feltanvendelsen af flotationsmetoden gjorde det muligt for os at kommunikere resultater til 400 ejere umiddelbart efter hver mikroskopisk aflæsning for at give anbefalinger vedrørende anthelmintiske behandlinger og forebyggende foranstaltninger og derfor undgå parasitspredning hos mennesker eller ledsagende dyr. Ligeledes gjorde flotationsteknikken i feltindstillingen det muligt at undersøge vildtlevende hunde og give dem en anthelmintisk behandling ved hjælp af godbidder eller mad. Figur 3A og figur 3B viser æg af henholdsvis T. canis og Ancylostoma spp., observeret efter flotationsopløsningen og teknikken blev udført i feltomgivelser. Når friske afføringsprøver blev udsat for flotationsmetoden i en feltindstilling, var opløsningen fremstillet i en sodavandsflaske i stand til at bringe helminthæg i flotation. Produktionen af saltkrystaller og luftbobler blev sammenlignet med prøverne aflæst i laboratorieomgivelser, og operatøren påviste ingen forskel. Denne observation er opmuntrende og udfordrer viden om, at koncentrationen af fækale prøver garanterer en mere nøjagtig mikroskopisk aflæsning.
Når flotationsopløsningen og afføringsprøverne blev behandlet i laboratorieomgivelser, blev der ikke opfattet nogen forskel med hensyn til morfologien og klarheden af aflæsningerne under mikroskopet, da den samme mængde affald flød samtidigt i både felt- og laboratoriekomikroskopisk påvisning af parasitter. Figur 3A,B viser henholdsvis T. canis og Ancylostoma spp. æg genvundet fra de 257 prøver, der blev behandlet i et fuldt udstyret laboratorium efter transport af prøver fra byområder, forstæder og landdistrikter. Disse parasitæg adskilte sig ikke morfologisk fra dem, der blev observeret under feltforhold (figur 3C).
Denne protokol genererede et tilstrækkeligt antal fund til at vurdere indflydelsen af placering, årstid, køn, race, alder og udendørs eller indendørs forhold i T. canis og Ancylostoma spp. prævalens. Prævalensdata blev sammenlignet ved hjælp af ANOVA-testen med en signifikansværdi på 0,05. Tabel 2 viser, at T. canis udviste en signifikant højere fordelingsfrekvens i tempererede og tørre klimaer sammenlignet med tilstande præget af varme klimaer, mens der ikke var nogen bemærkelsesværdig variation i forekomsten af Ancylostoma spp. på tværs af regioner med fremherskende varmt, tempereret eller tørt klima. Ligeledes opdages Ancylostoma spp. og T. canis oftest om sommeren. Det blev konstateret, at 60,86% af mændene var positive for ancylostomiasis og 37,38% for toxocariasis. Desuden blev T. canis hyppigere påvist hos hvalpe under 6 måneder; mens Ancylostoma spp. blev diagnosticeret mere hos voksne hunde. Interessant nok blev der ikke fundet nogen forskel mellem hunderacer. Hundens hageorm inficerede 65,54% af udendørs hunde; alligevel blev T. canis ligeledes påvist hos hunde med udendørs eller indendørs status.
Figur 1: Opsamling af afføringsprøver fra hunde. (A) Der skal udvises forsigtighed ved indsamling af afføringsprøver fra vildtlevende hunde. Når det er muligt, skal frisk afføring opsamles og opbevares i en plastikpose til indsendelse og coproparasitoskopisk analyse i laboratoriet. Prøverne nedkøles ved 4 °C og anbringes i styrofoamkasser eller isolerede metalhylstre senest 24 timer efter indsamlingen. (B) Tre gram afføring anbefales som standard; Derfor er 2-5 g rimeligt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fremstilling af en mættet saltopløsning og behandling af fækal suspension til mikroskopi. (A) Den ideelle massefylde af en mættet opløsning fremstillet med salt skal være over 1,20. Det anbefales stærkt at kontrollere, at der ikke er krystaller i bunden, og opløsningen er gennemsigtig. (B) At føre fækalsuspensionen gennem en plastsil fjerner grove partikler. C) Podningssløjfen skal udsættes for en flamme (en laboratoriebrænder eller en almindelig bærbar lighter) for at sikre, at den er fri for kontaminering. D) Lad podningssløjfen køle af, og tag tre dråber fra forskellige steder på suspensionens overflade. (E) Når du har placeret den første dråbe på glasglasset, skal du undgå at flytte objektglasset for at reducere spild af dråben. Glasobjektglasset giver en tynd og gennemsigtig platform, der giver mulighed for observation af prøver. (F) Placer den anden dråbe midt på glasglasset. At tage en anden dråbe fra overfladen af fækalsuspensionen øger sandsynligheden for at finde æg i en suspension, hvor parasitære strukturer kan have været ujævnt fordelt. (G) Anbring den tredje dråbe på glasglasset. En tredje dråbe fra overfladen af fækalsuspensionen tillader observation af et andet område, hvor flydende æg kan have koncentreret. (H) De tre dråber observeres separat på glasglasset for at detektere nematodeæg fra forskellige områder af overfladen af fækalsuspensionen. (I) Observer prøven under et mikroskop ved hjælp af 10x-målet. Hvis målet ændres til 40x, skal du placere en dæksel på fækale suspensionsdråber. Når der observeres et positivt resultat i dråben, tildeles et kryds (+) for at markere tilstedeværelsen af parasitter i patentperioden på tilfældige steder på fækalsuspensionsoverfladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Æg af Toxocara canis og Ancylostoma spp. påvist ved lysmikroskopi ved 40x forstørrelse. (A) Æg af Toxocara canis påvist ved lysmikroskopi ved 40x forstørrelse. Flotationsmetoden tillod visualisering af rene mikroskopiske felter fri for grove materialer (indsamlet i en feltindstilling). Uanset fremgangsmåden til fremstilling af flotationsopløsningen var æg synlige og hovedsageligt observeret uden morfologiske ændringer. B) Æg af Ancylostoma spp. påvist ved lysmikroskopi med 40x forstørrelse. Selvom der ikke blev udført nogen koncentration af afføring (i en feltindstilling), adresserede den enkle flotationsmetode manglerne ved morfologisk påvisning af æg i afføring, da proceduren blev udført i henhold til den nuværende metode. C) Æg af T. canis og Ancylostoma spp. påvist ved lysmikroskopi ved 40x forstørrelse. Morfologiske træk ved disse æg (genfundet i laboratorieomgivelser) var klare, selvom der ikke blev foretaget nogen koncentration af afføringsprøver og ikke adskilte sig fra de æg, der blev fundet i en markindstilling. Skalastænger = 75 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Ancylostoma spp. | Toxocara canis | ||
| Klima | Varmt klima | 38,66a | 22,52a |
| Tørt klima | 29.41a | 36.03a | |
| Tempereret klima | 31,93a | 41,44b | |
| Forår | 23,76a | 19,81a | |
| Sommer | 49,81b | 50.00b | |
| Efterår | 17.52a | 20.27a | |
| Vinter | 8,88c | 9,90c | |
| Køn | Mandlig | 60,86a | 62,61a |
| Kvindelig | 39.13b | 37,38b | |
| Alder | 0-3 måneder | 18,72a | 51,80a |
| 3-6 måneder | 15.48a | 32,43b | |
| > 6 måneder | 22.44a | 10,36c | |
| > 1 år | 43,33b | 5.40c | |
| Race | Krydsning | 52,78a | 55,86a |
| Racerene | 47.22a | 44.14a | |
| Boligstatus | Indendørs | 34.45a | 52,25a |
| Udendørs | 65,54a | 47,74b |
Tabel 2: Prævalens (%) af Ancylostoma spp. og Toxocara canis hos hunde i Mexico i løbet af 4 år i henhold til klima, sæson, køn, alder, race og boligstatus. Indikationer fra dataene afslører, at der ikke er nogen signifikant variation i forekomsten af Ancylostoma spp. på tværs af områder præget af varme, tempererede eller tørre klimaer. I modsætning hertil udviser T. canis en markant højere forekomst i tempererede og tørre klimaer sammenlignet med varme klimaer. Derudover identificeres både Ancylostoma spp. og T. canis hyppigst i sommersæsonen. Analyse af dataene viser yderligere, at 60,86% af hanhunde testede positivt for ancylostomiasis, mens 37,38% testede positivt for toxocariasis. Desuden er T. canis hyppigere påvist hos hvalpe under 6 måneder, mens Ancylostoma spp. er mere udbredt hos voksne hunde. Interessant nok blev der ikke observeret mærkbare forskelle mellem forskellige hunderacer. Resultaterne viser, at 65,54% af udendørs hunde er inficeret med hundehageorm, mens T. canis er lige så udbredt blandt indendørs og udendørs hunde. *Middelværdier inden for en kolonne af faktoren (klima, sæson, køn, alder, race og bolig) efterfulgt af de samme bogstaver er ikke signifikant forskellige ved P < 0,05 ifølge ANOVA Test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nematoder som T. canis og Ancylostoma spp. kan bebo tyndtarmen hos hunde og har potentiale til at blive overført til mennesker. Kliniske tegn forårsaget af T. canis er alvorlige hos unge hunde, manifesterer sig som dårlig vækst, åndedrætsbesvær eller læsioner i fordøjelseskanalen28. Hos voksne hunde har infektionen typisk tendens til at være mild. Diagnosen er afhængig af at identificere karakteristiske æg i en fækal prøve. Denne tilstand er en hyppig årsag til at ordinere anthelmintisk behandling til hunde29. For at forstå Toxocara's epidemiologi er det vigtigt at erkende, at parasitten kan overføres fra moderen til hvalpen både gennem moderkagen før fødslen og gennem amning som en galaktogen infektion kort efter whelping. Mennesker kan indgå kontrakt T. canis , når de indtager infektiøse æg, som kan forekomme på forskellige måder, såsom forurenet jord eller pels fra en inficeret hund. I dette tilfælde tjener mennesker som parateniske værter, og selvom der ikke er nogen parasitisk reproduktion, kan de frigivne larver fra æggene potentielt forårsage skade, især i tilfælde af børn30.
Infektion med hageorm Ancylostoma spp. hos hunde opstår, når dyrene indtager larverne, eller når larver trænger ind i huden. Hvalpe kan indgå infektionen ved at indtage en paratenisk vært eller gennem den laktogene vej31. Modne hageorm lever af blod, hvilket potentielt kan føre til alvorlig anæmi og gastrointestinale symptomer, især hos unge hunde. Infektioner, der opstår gennem huden, resulterer i dermatitis, som typisk løser omkring en uge efter infektionens begyndelse. Forskellige anthelmintiske lægemidler er blevet anvendt, ledsaget af understøttende terapi. Der har dog været rapporter om anthelmintisk resistens. Ancylostom har potentiale til at være patogen for mennesker. Den transkutane transmission af L3 larver kan føre til en tilstand kendt som kutane larve migrans. Disse læsioner forsvinder generelt uden behandling over et par måneder. I sjældne tilfælde kan hundens hageorm migrere ind i den menneskelige mave-tarmkanal, hvilket inducerer eosinofil enteritis30.
Den nøjagtige, økonomiske og hurtige diagnose af parasitose hos hunde er afgørende for at øge vores epidemiologiske viden om helminthiaser hos hunde. Af denne grund tilpassede vi en protokol for den enkle flotationsteknik, der skal bruges i en feltindstilling til at detektere T. canis og Ancylostoma spp. Et relevant problem i den nuværende protokol var indsamling af prøver fra vildtlevende hunde, da disse dyr normalt er svære at håndtere. Derfor blev prøveudtagning udført ved at observere og følge hundene, indtil de afføring, hvilket gjorde prøveudtagningsmetoden tidskrævende, udfordrende og på en eller anden måde farlig. Ifølge vores erfaring anbefaler vi kraftigt at vurdere parasitologiske undersøgelser hos internathunde.
Med hensyn til den zoonotiske helminthæggenvinding er kvalitativ coproskopi fortsat den metode, der almindeligvis anvendes i parasitologilaboratoriet til diagnostiske formål1. Tidligere undersøgelser har vist, at flotationsteknikken ved anvendelse af en mættet saltopløsning er mere pålidelig end direkte mikroskopi. For eksempel bestemte Dryden og samarbejdspartnere en følsomhed på 95,15% for Ancylostoma spp. æg i 206 fækale prøver behandlet ved flotationsteknikken og 27,18% ved direkte mikroskopi32. Det accepteres, at flotationsopløsningens massefylde er en kritisk faktor for flotationsmetoden 14,20,23. I opløsninger, der ikke når denne tæthed, tager de parasitære former længere tid at flyde eller aldrig flyde. Når en flotationsopløsning er overmættet, krystalliserer den om et par minutter og endnu tidligere, hvis en dæksel placeres20.
Valget af flotationsløsningen i denne protokol var baseret på let forberedelse, bekvemmelighed, omkostninger og miljøpåvirkning. Selvom sukkeropløsningen tager længere tid at krystallisere, skal formalin eller phenol tilsættes som konserveringsmiddel og mindske den klæbrige eller klæbende fornemmelse; hvilket er en ulempe under de feltforhold, der herskede i denne undersøgelse. Desuden er bortskaffelse af kemiske reagenser et komplekst spørgsmål på grund af miljøbestemmelser. Data i denne undersøgelse viste, at den mættede opløsning fremstillet med almindeligt bordsalt under feltbetingelser ved hjælp af en sodavandsflaske på grund af manglende tilgængelighed af laboratorieudstyr til fremstilling og kogning af en flotationsopløsning var lige så effektiv som den, der blev fremstillet i laboratorieomgivelser. Den eneste mærkbare forskel er den længere tid, det tager at ryste sodavandsflasken, indtil en gennemsigtig opløsning kan ses. Mikroskopiske observationer var lige rene for prøven fremstillet ved hjælp af begge metoder til fremstilling af den mættede opløsning. Det er vigtigt at udføre flere undersøgelser i fremtiden med et større antal prøver for at bekræfte ovennævnte erklæring. Alligevel er det tidskrævende og har brug for den fysiske indsats for at ryste opløsningen inde i flasken i timevis. Et andet kritisk trin i protokollen består i at lade fækalsuspensionen stå i mindst 15 minutter for at lade æggene flyde og koncentrere sig på overfladen. Men jo længere hviletid er, desto mere affald vil flyde, og efter et par timer vil æggene deformere eller bryde. I betragtning af at følsomheden og specificiteten af coproparasitoskopiske metoder er lav, og at nøjagtigheden af disse metoder som diagnostiske tests afhænger af brugerens færdigheder, udførte uddannede og erfarne parasitologer i den aktuelle undersøgelse flotationsteknikken og identificerede parasitterne.
Denne undersøgelse er, så vidt vi ved, den første til at estimere forekomsten af Ancylostoma spp. og T. canis hos hunde i Mexico ved hjælp af fækale prøver undersøgt med den enkle flotationsmetode i en feltindstilling. Det blev heri demonstreret, at den flotationsteknik, vi brugte, på trods af de årtier, den har været i brug, stadig er en yderst effektiv, økonomisk og hurtig diagnostisk test14. Alligevel er der coproparasitoskopiske teknikker med højere følsomhed og specificitet end den, vi brugte til diagnosticering af hundehelminths; såsom sedimentationskoncentrationen, som det er tilfældet med Faust-teknikken. Desuden er det vigtigt at bemærke, at Faust, som er en koncentrationsmetode, også har vist sig at være mere effektiv til påvisning af protozoer som Giardia33. Ikke desto mindre havde den coproparasitoskopiske metode, vi valgte til denne undersøgelse, flere fordele såsom omkostninger. Faust-teknikken er dyrere end flotation med saltvandsmættet opløsning, fordi den kræver ekstra og dyrt udstyr såsom en centrifuge. Andre koncentrationsmetoder, såsom dem, der bruger reagenser såsom zinksulfat, er dyrere end almindeligt salt og har brug for mere tid på grund af antallet af de krævede vaske i centrifugen. Derfor er Faust-teknikken begrænset til dens anvendelse i feltarbejde, hvor ingen adgang til en centrifuge er almindelig.
Vigtigst er det, at en begrænsning af den enkle flotationsteknik er, at den ikke er følsom nok til at detektere Cryptosporidium oocyster, Giardia cyster eller Trichuris æg. Der bør derfor anvendes teknikker til centrifugering af parasitformer til koncentration af parasitformer, hvis diagnosen af disse arter påtænkes. Det er vigtigt at fremhæve, at positivitetsraterne for de slægter, der er rapporteret i denne undersøgelse, ikke bør betragtes som afgørende, fordi en bekvemmelighedsmetode blev anvendt som prøveudtagningsstrategi. Det er vigtigt at bemærke, at der kan være situationer, såsom i internater med udfordrende dyreforvaltning, hvor det bliver afgørende at identificere helminthparasitter hos hunde. Som følge heraf kan det være nødvendigt at justere denne protokol i fremtiden for at tage højde for indsamlingen af kombinerede prøver.
Som et svagt punkt skal det bemærkes, at den enkle flotationsmetode og fremstillingen af den mættede opløsning af NaCl blev udviklet til et specifikt formål - at undersøge hundeafføring under for det meste feltforhold - men følsomheden af den enkle flotationsprocedure er generelt blevet anset for at være lav. For at detektere cyster eller æg af tungere parasitarter foreslås det derfor stærkt at anvende en koncentrationsteknik. I betragtning af den enkle flotationsmetodes lave følsomhed, uanset om den udføres i felt- eller laboratorieindstilling, var det rimeligt at tvivle på, om denne teknik ville være nyttig som en metode til valg af epidemiologiske undersøgelser af hunde helminth parasitter. Ikke desto mindre indikerer den høje prævalens af Ancylostoma spp. hos hunde i denne undersøgelse og påvisningen af T. canis-æg , at den enkle flotationsmetode, uanset om den udføres i felt- eller laboratorieomgivelser, er nyttig til at tilvejebringe dokumentation, der kan understøtte yderligere epidemiologiske undersøgelser og foreslå kontrol- og forebyggende foranstaltninger for at reducere infektionen af hunde og mennesker med disse nematoder.
Ved hjælp af den enkle flotationsmetode analyserede vi de faktorer, der påvirker T. canis og Ancylostoma spp. æggenvinding fra hundeafføring. T. canis resultater var i overensstemmelse med den seneste forskning, der tyder på, at parasitter er betydeligt mere udbredt i tempererede og tropiske områder. Dette stemmer overens med tidligere undersøgelser, der har undersøgt, hvordan miljøfaktorer, især temperatur og nedbør, påvirker det økologiske område af parasitarter 34,35,36. De nuværende resultater viste, at begge helminths inficerer mænd i en signifikant højere andel. Det er rimeligt at spekulere i, at dette fund skyldtes, at mænd er immunologisk mindre reaktive over for infektioner37,38. Alder påvirker forekomsten af T. canis, da hvalpe blev mere påvirket af denne parasit. Dette fund stemmer overens med tidligere forskning, der tyder på, at denne parasit har tendens til at påvirke hvalpe i større grad, mens voksne udvikler øget resistens, hvilket resulterer i en lavere sandsynlighed for infektion 6,39. Både krydsede og racerene hunde viste sammenlignelige prævalenser af Toxocara canis og Ancylostoma spp. Imidlertid udviste vildtlevende hunde en højere forekomst af Ancylostoma spp. sammenlignet med hunde, der boede i hjemlige omgivelser. Dette resultat er i modstrid med tidligere rapporter, der ikke opdagede forskelle mellem hunderacer6. Det kan konkluderes, at fremtidige anvendelser af fremstillingen af den mættede saltopløsning og den enkle flotationsmetode, der anvendes i denne protokol, kan udføres til rutinemæssige fækale undersøgelser under felt- eller laboratoriebetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige over for Dirección General de Asuntos del Personal Académico ved Universidad Nacional Autónoma de México for at have stillet de økonomiske ressourcer til rådighed gennem tilskud PAPIIT IN218720 og Dr. Claudia Mendoza for at have givet den ønskede forlængelse. Dette arbejde er dedikeret til min dejlige Nicole, der døde i 2019. Du vil altid leve i mit hjerte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
References
- Duncan, K. T., Koons, N. R., Litherland, M. A., Little, S. E., Nagamori, Y. Prevalence of intestinal parasites in fecal samples and estimation of parasite contamination from dog parks in central Oklahoma. Veterinary Parasitology Regional Studies and Reports. 19, 100362 (2020).
- Kisiel, L. M., et al. Owned dog ecology and demography in Villa de Tezontepec, Hidalgo, Mexico. Preventive Veterinary Medicine. 135, 37-46 (2016).
- Lyons, M. A., Malhotra, R., Thompson, C. W. Investigating the free-roaming dog population and gastrointestinal parasite diversity in Tulúm, México. PLoS One. 17 (10), e0276880 (2022).
- Dantas-Torres, F., et al. TROCCAP recommendations for the diagnosis, prevention and treatment of parasitic infections in dogs and cats in the tropics. Veterinary Parasitology. 283, (2020).
- Cantó, G. J., García, M. P., García, A., Guerrero, M. J., Mosqueda, J. The prevalence and abundance of helminth parasites in stray dogs from the city of Querétaro in central Mexico. Journal Of Helminthology. 85 (3), 263-269 (2011).
- Torres-Chablé, O. M., et al. Prevalence of gastrointestinal parasites in domestic dogs in Tabasco, Southeastern Mexico. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 24 (4), 432-437 (2015).
- Cortez-Aguirre, G. R., Jiménez-Coello, M., Gutiérrez-Blanco, E., Ortega-Pacheco, A. Stray dog population in a city of Southern Mexico and its impact on the contamination of public areas. Veterinary Medicine International. 2018, 1-6 (2018).
- Rodríguez-Vivas, R. I., et al. An epidemiological study of intestinal parasites of dogs from Yucatán, Mexico, and their risk to public health. Vector Borne Zoonotic Diseases. 11 (8), 1141-1144 (2011).
- Maggi, R. G., Krämer, F. A review on the occurrence of companion vector-borne diseases in pet animals in Latin America. Parasites & Vectors. 12 (1), 145 (2019).
- Cruz-Vazquez, C., Castro, G., Parada, F., Ramos, P. Seasonal occurrence of Ctenocephalides felis and Ctenocephalides canis (siphonaptera:Pulicidae) infesting dogs and cats in an urban area in Cuernavaca, Mexico. Entomological Society of America. 38 (1), 111-113 (2001).
- Bolio-Gonzalez, M. E., et al. Prevalence of the Dirofilaria immitis infection in dogs from Mérida, Yucatán, Mexico. Veterinary Parasitology. 148 (2), 166-169 (2007).
- Pastor-Santiago, J. A., Flisser, A., Chávez-López, S., Guzmán-Bracho, C., Olivo-Díaz, A. American visceral leishmaniasis in Chiapas, Mexico. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86 (1), 108-114 (2012).
- Trasviña-Muñoz, E., et al. Detection of intestinal parasites in stray dogs from a farming and cattle region of Northwestern Wexico. Pathogens. 9 (7), (2020).
- Ballweber, L. R., Beugnet, F., Marchiondo, A. A., Payne, P. A. American Association of Veterinary Parasitologists' review of veterinary fecal flotation methods and factors influencing their accuracy and use--is there really one best technique. Veterinary Parasitology. 204 (1-2), 73-80 (2014).
- Nielsen, M. K. What makes a good fecal egg count technique. Veterinary Parasitology. 296, 109509 (2021).
- Gordon, H. M., Whitlock, H. V. A new technique for counting nematode eggs in sheep faeces. Journal of the Council for Scientific and Industrial Research. 12 (1), 50-52 (1939).
- O'grady, M. R., Slocombe, J. O. D. An investigation of variables in a fecal flotation technique. Canadian Journal of Comparative Medicine. 44 (2), 148 (1980).
- ESCCAP. Worm control in dogs and cats. Guideline 01. European Scientific Counsel Companion Animal Parasites. , (2017).
- Cringoli, G., et al. Ancylostoma caninum: Calibration and comparison of diagnostic accuracy of flotation in tube, McMaster and FLOTAC in faecal samples of dogs. Experimental Parasitology. 128 (1), 32-37 (2011).
- Figueroa, C. J. A. Examen coproparasitoscópico. In: Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria, Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal. AMPAVE-CONASA. , 83-105 (2015).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Adolph, C., et al. Diagnostic strategies to reveal covert infections with intestinal helminths in dogs. Veterinary Parasitology. 247, 108-112 (2017).
- Cringoli, G., Rinaldi, L., Maurelli, M. P., Utzinger, J. FLOTAC: New multivalent techniques for qualitative and quantitative copromicroscopic diagnosis of parasites in animals and humans. Nature Protocols. 5 (3), 503-515 (2010).
- Katagiri, S., Oliveira-Sequeira, T. C. Comparison of three concentration methods for the recovery of canine intestinal parasites from stool samples. Experimental Parasitology. 126 (2), 214-216 (2010).
- Rehbein, S., Lindner, T., Visser, M., Winter, R. Evaluation of a double centrifugation technique for the detection of Anoplocephala eggs in horse faeces. Journal of Helminthology. 85 (4), 409-414 (2011).
- Liccioli, S., et al. Sensitivity of double centrifugation sugar fecal flotation for detecting intestinal helminths in coyotes (Canis latrans). Journal of Wildlife Diseases. 48 (3), 717-723 (2012).
- Rishniw, M., Liotta, J., Bellosa, M., Bowman, D., Simpson, K. W. Comparison of 4 Giardia diagnostic tests in diagnosis of naturally acquired canine chronic subclinical giardiasis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 24 (2), 293-297 (2010).
- Barutzki, D., Schaper, R. Endoparasites in dogs and cats in Germany 1999-2002. Parasitology Research. 90, S148-S150 (2003).
- Carlin, E. P., Tyungu, D. L. Toxocara: Protecting pets and improving the lives of people. Advances in Parasitology. 109, 3-16 (2020).
- Saari, S., NaReaho, A., Nikander, S. Canine parasites and parasitic diseases. , Academic Press. (2019).
- Bowman, D. D., Montgomery, S. P., Zajac, A. M., Eberhard, M. L., Kazacos, K. R. Hookworms of dogs and cats as agents of cutaneous larva migrans. Trends in Parasitology. 26 (4), 162-167 (2010).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Barutzki, D., Schaper, R. Results of parasitological examinations of faecal samples from cats and dogs in Germany between 2003 and 2010. Parasitology Research. 109, S45-S60 (2011).
- Novobilský, A., Novák, J., Björkman, C., Höglund, J. Impact of meteorological and environmental factors on the spatial distribution of Fasciola hepatica in beef cattle herds in Sweden. BMC Veterinary Research. 11, 128 (2015).
- Pickles, R. S., Thornton, D., Feldman, R., Marques, A., Murray, D. L. Predicting shifts in parasite distribution with climate change: A multitrophic level approach. Global Change Biology. 19 (9), 2645-2654 (2013).
- Pérez-Rodríguez, A., De La Hera, I., Fernández-González, S., Pérez-Tris, J. Global warming will reshuffle the areas of high prevalence and richness of three genera of avian blood parasites. Global Chaneg Biology. 20 (8), 2406-2416 (2014).
- Nava-Castro, K., Hernández-Bello, R., Muñiz-Hernández, S., Camacho-Arroyo, I., Morales-Montor, J. Sex steroids, immune system, and parasitic infections: Facts and hypotheses. Annals Of The New York Academy Of Sciences. 1262, 16-26 (2012).
- Morales-Montor, J., Escobedo, G., Vargas-Villavicencio, J. A., Larralde, C. The neuroimmunoendocrine network in the complex host-parasite relationship during murine cysticercosis. Current Topics in Medicinal Chemistry. 8 (5), 400-407 (2008).
- Olave-Leyva, J., et al. Prevalencia de helmintos gastrointestinales en perros procedentes del servicio de salud de Tulancingo, Hidalgo. Abanico Veterinario. 9 (1), 1-10 (2019).
