Summary
이 연구는 2017년부터 2021년까지 멕시코의 개에서 채취한 분변 샘플에서 검출된 Toxocara canis 와 Ancylostoma spp.를 현장 조건에서 식별하기 위해 부유선광법을 사용하는 방법을 설명합니다.
Abstract
Toxocara canis 및 Ancylostoma caninum과 같은 인수공통감염병 가능성이 있는 개 기생충의 진단은 멕시코의 시골 및 교외 지역의 실험실에 대한 접근이 제한되어 있기 때문에 일반적으로 어렵습니다. 이 연구는 2017년부터 2021년까지 멕시코의 개에서 채취한 분변 샘플에서 T. canis와 Ancylostoma spp.를 현장 조건에서 검출하는 것을 목표로 했습니다. 표본 크기 계산 결과 전국에 534마리의 개가 등록되는 것을 목표로 삼았습니다.
샘플은 배변 후 직장 또는 땅에서 직접 수집되었습니다. 샘플은 4°C에서 개별적으로 단단히 밀봉된 비닐 봉지에 보관했습니다. 염화나트륨의 포화 용액(비중[SpG] 1.20)을 현장 및 실험실 조건 모두에서 제조하였다. 채취 후 3일 이내에 2-4g의 대변을 각 대변 샘플을 식염수에 부유시켜 부유 선광 방법을 사용하여 기생충 검사를 실시했습니다. 대변을 부유 용액과 혼합하고 금속 숟가락을 사용하여 분쇄했습니다.
균일한 일관성이 달성되면 대변 샘플을 체를 사용하여 새 플라스틱 컵에 붓고 10-15분 동안 그대로 두었습니다. 혼합물의 상단에서 3방울을 멸균된 접종 루프를 사용하여 수집했습니다. 슬라이드를 현미경에 놓고 훈련된 기생충학자가 기생충을 식별했습니다. 1,055마리의 개에서 채취한 배설물 샘플을 현미경으로 검사했습니다. Ancylostoma spp.의 양성 샘플 수는 T. canis의 경우 833개(78.95% 빈도), 222개(21.04%)였습니다. 이러한 발견은 멕시코의 도시와 농촌 지역에 사는 개에서 실험실과 현장 조건에서 공동 기생충 기술을 사용하여 인수공통전염병을 식별하는 것의 중요성을 보여줍니다.
Introduction
위장 기생충은 개에게 영향을 미치는 가장 흔한 건강 문제 중 하나입니다1. 추정에 따르면 전 세계적으로 ~7억 마리의 반려견이 있으며, 약 1억 7,500만 마리가 자유롭게 돌아다니는 것으로 분류될 수 있습니다2. 60종 이상의 기생충이 개와 인간 사이에 공유되고 있으며, 이는 개가 이러한 기생충에 감염된 인간의 감염원이 될 수 있음을 시사한다3. 톡소카라 카니스(Toxocara canis)와 안시로스토마 카니눔(Ancylostoma caninum)은 개와 우연히 인간 숙주를 감염시키는 두 가지 기생 종입니다. 현재 멕시코에서 이 기생충이 생존하고 번식할 수 있는 위치에 대한 여러 연구가 있습니다. 개에서 톡소카라의 유병률은 미국, 멕시코, 중미 및 카리브해 전역에서 0%에서 87% 이상까지 다양합니다4. 톡소카라 카니스(Toxocara canis)와 안시로스토마(Ancylostoma spp.) 및 개의 다른 기생 종은 이전에 멕시코에서 보고된 바 있다 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (표 1).
| 기생 종 | 부위 | 유병률(%) | 참조 |
| Ancylostoma caninum (안시로스토마 캐니눔) | 케레타로 | 42.90 | 5 |
| 타바스코 소스 | 15.90 | 6 | |
| 캄페체 | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| 유카탄 | 73.8 | 8 | |
| 바베시아 | 모렐로스 | 13.60 | 9 |
| 베라 크루즈 | 10.00 | ||
| 콕시디얼 난포낭 | 유카탄 | 2.30 | 8 |
| 크테노세팔리데스 | 모렐로스 | 30.3 | 10 |
| 디필리디움 카니눔 | 유카탄 | 2.30 | 8 |
| 디로필라리아 | 유카탄 | 7.0 – 8.3 | 11 |
| 편모충 | 타바스코 소스 | 3.00 | 6 |
| 유카탄 | 18.8 | 8 | |
| 리슈마니아 | 치아파스 | 19.00 | 12 |
| 촌 충 | 바하 칼리포르니아 | 6.79 | 13 |
| 톡소카라 카니스 | 케레타로 | 22.10 | 5 |
| 유카탄 | 6.20 | 8 | |
| 트리쿠리스 불피스(Trichuris vulpis) | 유카탄 | 25.40 | 8 |
| 트리파노소마(Trypanosoma) | 할리 스코 | 8.10 | 9 |
| 캄페체 | 7.60 | ||
| 치아파스 | 4.5 – 42.8 | ||
| 킨타나로오 | 20.1 – 21.3 | ||
| 톨 루카 | 17.50 | ||
| 유카탄 | 9.8 – 34 |
표 1: 2001년부터 2020년까지 멕시코의 개 기생충의 지역별 유병률(%). 2001년부터 2020년까지 수행된 이전 조사의 결과를 통해 멕시코의 여러 도시 및 농촌 환경에서 개 기생충 분포를 식별할 수 있었습니다. 이러한 연구는 다양한 생태계에서 개 기생충의 지속성에 도움이 되는 역학적 요소에 대한 깊은 이해를 제공하여 일부 기생충 종의 인수공통감염병 영향에 대한 포괄적인 평가에 기여합니다.
알, 낭종, 난포 또는 유충과 같은 장내 기생충의 생애 주기 단계는 대변 샘플에서 찾을 수 있습니다. 따라서 배설물을 검사하면 동물의 기생충에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 인간의 대변에서 Ancylostomidae 알을 검출하는 방법에 대한 필요성으로 인해 1878 년에 간단한 대변 도말이 사용되었으며, 이는 수년 동안 위장 기생충을 검출하는 데 사용되었지만 그다지 민감하지 않은 것으로 간주되었습니다. 따라서 더 나은 공미시적 방법을 개발할 필요성이 제기되었습니다14. 대변 샘플에서 기생충 알을 회수하고 계수하는 부유 선광 기술이 처음 기술된 지100년 이상이 지났습니다 15. 그 이후로 부양 기술의 여러 방법과 변형이 숙주에서 일부 기생충을 검출하기위한 표준으로 간주되었습니다.
예를 들어, Lane은 1924년에 원심분리를 통합한 후 SpG 1.2 in 1g(Lane) 또는 10g(Stoll's modification)의 포화 염화나트륨 용액에 침전물을 띄우는 직접 원심 부유 기술을 포함하는 방법을 설명했습니다. 부유 기술은 이후에 상이한 SpG14를 갖는 용액을 사용하여 수정하였다. 1939년 Gordon과 Whitlock은 기생충 알을 시각화할 때 찌꺼기의 간섭으로 인한 Stoll 기술의 단점을 보고하고 McMaster16으로 알려진 정량적 방법을 개발했습니다. 1979년에, 오그래디(O'Grady)와 슬로콤(Slocombe)은 용액의 비중, 타이밍 및 스트레이너의 메쉬 크기가 부유 기술17을 사용하여 계란 검출의 정확도에 영향을 미친다는 것을 증명하였다. 지난 수십 년 동안 부유 선광 기술에 몇 가지 수정이 이루어졌기 때문에 부양 방법의 표준화가 시급합니다. 현재, 인수공통선충의 감염 단계로 인한 환경 오염을 제한하기 위해 적절한 구충 치료를 적용하기 위해 인수공통감염병 예방의 맥락에서 개 기생충 감염을 검출하는 것이 필요하다18.
정성적 방법 중에서 분변 부유 기술은 많은 장비가 필요하지 않고 간단하고 저렴하며 재현 가능하기 때문에 널리 사용되고 수용됩니다. 그러나 감염 강도가 낮을 때 민감도가 떨어진다는 큰 단점이 있다19. 알, 난포, 낭종, 또는 선충 유충과 같은 더 많은 수의 기생 요소의 존재를 드러내는 능력은 통상적으로 용액(20)의 밀도에 의해 결정된다.
이전 보고서에서는 개 선충 알을 검출하기 위한 공기생충 기술을 비교했습니다. 운동성 원생동물의 검출과 관련하여 직접 분변 도말이 사용됩니다. 침강 방법은 trematodes21과 같은 기생충의 무거운 알을 진단하는 데 유용합니다. 가장 널리 사용되는 현장 기반 진단 검사 중 하나는 대변 도말 방법입니다. 그러나 이 기술의 낮은 수준의 감도는 기생충 알의 감지를 방해하는 파편이 포함되어 있다는 사실에 기인할 수 있습니다. 적절한 SpG를 제공하는 용액과 함께 체질 단계를 통합함으로써 부유선광 분석법은 무서룩 및 십이지장충 알을 보다 명확하고 덜 복잡하게 관찰할 수 있습니다. 이는 현미경 스크리닝을 위한 보다 정밀하고 효율적인 프로세스로 이어진다22. 마찬가지로, 단순 부유선광법과 직접 원심 부유선광법은 기생충 알과 난포낭을 회수하기 위해 매우 일반적으로 활용된다14. 고전적인 부유 선광 방법은 McMaster 방법15와 같은 계수 챔버의 사용에 따라 정성적 또는 정량적 인 것으로 간주 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 부유 선광 기술은 민감도가 낮고 특허 기간 동안 기생충 검출에 중점을 두기 때문에 부정적인 결과가 결정적인 것으로 간주되어서는 안 됩니다. 그러나 정확도는 분변 샘플의 보존 절차 또는 부유 용액의 SpG에 따라 달라질 뿐만 아니라 사용자의 분변 검사 수행에 대한 기술적 숙련도와 경험에 따라 달라집니다.
결과적으로, 대변에서 개 기생충을 검출하기 위한 다른 방법이 연구되었습니다. 개의 장내 기생충 감염 진단을 위해 가장 널리 사용되는 접근법 중 하나는 튜브 내의 부유 프로토콜 및 맥마스터 기법(McMaster technique)과 비교할 때 개의 A. caninum 진단을 위한 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 산출하는 다가 민감하고 정확한 방법인 FLOTAC 기법인 FLOTAC 기법이라는 것이 일반적으로 인식되어 왔다. 23. 침전법은 흡충 알, 배아 선충 알 및 대부분의 촌충 알을 회수하는 데 유용하며, 이러한 구조물은 부유하지 않기 때문에 부유 용액의 표면에서 회수할 수 없다24. 부유선광/침강 기법보다 우수한 것으로 입증된 한 가지 방법은 변변 내 세스토드 알을 검출할 수 있고, 시간이 덜 걸리며, 분변 파편에서 아노플로세팔라 알을 분리하고, 결정화를 감소시키기 때문에 수정된 이중 원심 부유선광법이다25. 더욱이, 이 기술은 고감도26으로 아스카리드 알을 검출하는데 성공적으로 사용되었다. 그러나 앞서 언급한 기술 및 Ovassay와 같은 원심 분리 방법 중 일부는 이 연구에서 제안하는 부유 프로토콜과 달리 포르말린, 상용 키트, 실험실 조건에서의 샘플 처리, 고가의 황산아연27과 같은 시약의 사용과 같은 시약의 사용이 필요하며 환경 독성을 피하기 위해 특별한 폐기 절차가 필요합니다.
최근에는 SpG가 높은 용액을 첨가하여 부유선광법의 감도를 높이는 기법을 사용하는 것이 선호되고 있습니다. 그러나 이러한 솔루션의 단점은 최종 준비에서 파편이 증가하여 기생충 알이 부정확하다는 점을 고려해야합니다. 또한, 재료, 시약, 비용, 환경 영향 문제 및 원심 방법의 사용의 어려움의 상업적 가용성은 부유 기술14의 선택에 영향을 미치며, 이는 우리가 본 연구에서 제시하는 프로토콜과 달리 현장 조건에서 어려울 수 있습니다. 식염으로 부유 용액을 준비하는 것은 현장 조건에서 설탕이 말벌 및 꿀벌과 같은 곤충을 유인하고 준비가 끈적 거리기 때문에 설탕을 사용하는 것보다 유리합니다. 또한, 끈적임을 피하기 위해 설탕 용액에 첨가되는 페놀 또는 ZnSO4와 같은 용액은 환경 보호 지침에 따라 적절하게 폐기하기가 복잡하고 현장에서 폐기할 수 없습니다. 식염 용액과 달리.
이 원고의 목표는 현장 및 실험실 조건에서 간단한 부유 기술을 적용하여 대변 샘플에서 T. canis 및 Ancylostoma spp. 알을 검출하는 단계를 보여주는 것입니다. 여기에 설명된 프로토콜에 따라 백업 배터리가 있는 현미경을 사용하여 실험실 장비 및 인프라를 사용할 수 없는 경우 시골 및 교외 지역에서 이러한 개 인수공통감염병 기생충을 진단할 수 있습니다. 이 연구에서 설명하는 간단한 부유선광 방법은 빠른 결과를 제공할 수 있으며 일상적인 스크리닝을 위한 비침습적이고 비용 효율적인 기술입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
개의 사용과 관리는 멕시코 국립 자치 대학교의 승인을 받았습니다.
1. 분변 시료 채취
알림: 수의사나 동물 주인의 도움을 받아 개를 다루십시오.
- 들개(그림 1A) 또는 신경질적인 동물의 경우 배변 직후 또는 10분 이내에 땅에서 샘플을 채취합니다.
- 수술용 장갑이나 얇은 벽의 폴리에틸렌 백에 물이나 바셀린을 바르십시오. 직장에서 대변 샘플을 수집하려면 수술용 장갑이나 얇은 벽의 폴리에틸렌 백을 착용하십시오.
- 각 개에서 최소 2g의 대변을 수집하십시오(그림 1B).
- 날짜, 위치(Google 지도를 사용한 GPS(Global Positioning System) 좌표), 각 동물의 식별 번호 할당, 개의 대략적인 나이, 개의 성별, 품종, 실내 또는 실외(야생) 개.
- 대변 샘플이 들어 있는 가방을 단단히 매듭으로 닫습니다. 채취 후 3-4시간 이내에 대변 샘플을 분석하지 않으면 백을 냉장(4-8°C)에 보관하십시오.
2. 현장 진단을 위한 포화 염 용액의 준비
알림: 물을 끓이기 위한 저울, 측정 재료, 스토브 또는 가스에 대한 접근이 없거나 제한된 경우 물, 일반 식염, 플라스틱 12oz(355mL) 컵 및 1L 소다 플라스틱 빈 병을 사용하여 포화 식염수를 쉽게 준비할 수 있습니다.
- 빈 1L 소다병을 깨끗이 씻으십시오. 병에 물 1L를 채웁니다.
- 12온스 플라스틱 컵에 일반 식탁용 소금을 채웁니다.
- 소금을 소다병에 옮깁니다.
- 나사 캡으로 음료수 병을 단단히 닫습니다. 소금이 더 이상 녹지 않을 때까지 용액을 세게 흔듭니다.
알림: 소금이 완전히 녹을 때까지 소다병의 용액을 흔드는 데 최대 90분이 소요될 수 있습니다.
3. 실험실 진단을 위한 포화 염 용액의 준비
- 일반 식탁용 소금 420g의 무게를 잰다.
- 물 1L에 소금 420g을 녹입니다.
- 더 이상 소금이 녹지 않을 때까지 용액을 끓입니다.
- 용액을 여과하여 용해되지 않은 소금을 버립니다.
- 무거운 유체 비중계 또는 밀도계를 사용하여 용액의 농도를 확인하십시오.
알림: 이상적인 농도는 더 나은 결과를 얻기 위해 1.20의 SpG를 갖습니다(그림 2A). 달걀의 부유 능력은 용액과의 상호 작용에 의해 영향을 받아 동일한 비중을 가진 용액에서 달걀이 뜨는 다양한 능력에 기여합니다. 따라서 최적의 난자 회수를 달성하기 위해서는 부유 용액에서 비중의 상한 범위를 고려하여 표적 기생충 요소6의 비중을 능가하도록 하는 것이 필수적이다.
4. 부양 방법
알림: 분변 샘플이 너무 건조하거나 딱딱하면 절구에 담그십시오.
- 숟가락을 사용하여 플라스틱 컵 1개(높이 ~8.5cm, 지름 ~5.5cm)에 약 3g의 대변을 넣습니다.
- 페이스트가 나올 때까지 포화 소금 용액 1mL를 추가합니다.
- 1분 동안 저어주고 포화 소금 용액 100mL를 추가합니다.
- 거친 입자를 피하기 위해 이 서스펜션을 플라스틱 스트레이너를 통해 두 번째 플라스틱 컵에 통과시킵니다(그림 2B).
- 서스펜션을 15-20분 동안 그대로 두십시오.
- 접종 루프를 화염에 1초 동안 넣어 난자, 낭종 또는 난포낭이 없는지 확인합니다(그림 2C).
- 접종 루프가 식을 때까지 5초 동안 기다립니다(그림 2D).
- 접종 루프가 있는 현탁액 표면에서 세 방울을 떨어뜨립니다. 세 방울을 각각 하나의 유리 슬라이드에 따로 놓습니다(그림 2E-G).
알림: 방울이 서로 접촉하지 않도록 하십시오(그림 2H). - 10x 대물렌즈로 현미경으로 관찰합니다(그림 2I). 배율이 40배로 증가하면 커버슬립을 놓습니다.
- 액적에서 양성 결과가 관찰되면 실험실 로그북에 십자형(+)을 할당하여 분변 현탁액 표면의 무작위 부위에 특허 기간 동안 기생충의 존재를 기록합니다.
5. 부유선광법의 해석
참고: 부정적인 결과는 결정적이지 않습니다.
- 테스트의 민감도를 높이기 위해 연속 3일의 샘플로 일련의 3가지 테스트를 수행합니다.
참고: 양성 결과는 특허 기간 동안 기생충의 존재를 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 연구에서는 T. canis 및 Ancylostoma spp.의 식별을 위한 수집 및 공동 기생경 절차에 대해 설명합니다. 개 기생충 알을 검출하기 위해 간단한 분변 부유 선광 방법을 적용하는 이유는 이 기술이 솔루션, 장비 및 재료가 저렴하기 때문에 비용 효율적이기 때문입니다. 따라서 이 방법은 짧은 시간에 여러 샘플을 처리할 수 있으므로 높은 샘플 처리 용량을 가지고 있습니다. 또한, 간단한 분변 부유선광법은 수행하기 쉽고 상대적으로 민감합니다.
표본 크기와 동물의 선택은 주로 동물 주인의 의지와 접근하는 들개의 안전에 의해 결정되는 편의에 의해 이루어졌습니다. 본 연구에서는 2017년부터 4년 동안 멕시코에서 개 Canis lupus familiaris에서 Ancylostoma spp. 및 T. canis의 발생 및 빈도를 평가하기 위해 부유 방법을 사용했습니다. 1,638마리의 개에서 배설물 샘플을 채취하여 현미경으로 검사했습니다. 총 1,235마리의 개가 T. canis와 Ancylostoma spp.에 양성 반응을 보였습니다. 부유선광법을 사용하는 목표 중 하나는 톡소카라 또는 안시로스토마의 발생을 측정하는 데 효과적임을 입증하는 것이었지만, 유병률에 영향을 미칠 수 있는 요인에 대한 심층 조사를 수행하는 것도 목표로 했습니다. 그 결과, 혼합 감염을 가진 185마리의 동물이 폐기되었습니다. Ancylostoma spp.의 양성 샘플 수는 T. canis의 경우 833개(78.95% 빈도), 222개(21.04%)였습니다. 1,050개의 샘플 중 75.5%(793개 샘플)는 소다병으로 부유 용액을 준비하고 4시간 연속 작동을 위해 3 x 1.2V AA 충전식 배터리가 있는 현미경을 사용하여 현장 환경에서 처리 및 판독되었습니다. 나머지 257개의 분변 샘플은 실험실에서 검사되었습니다.
이 연구의 목표는 실험실 인프라나 장비를 사용할 수 없는 지역에서 개의 두 가지 기생충 진단을 가속화하고 용이하게 하기 위해 현장 환경에서 부양 용액과 방법을 사용하는 것이었습니다. 부유선광법의 현장 적용을 통해 각 현미경 판독 직후 400명의 소유자에게 결과를 전달하여 구충제 치료 및 예방 조치에 대한 권장 사항을 제공하여 사람이나 반려동물에게 기생충이 퍼지는 것을 방지할 수 있었습니다. 마찬가지로, 현장 환경에서의 부양 기술은 들개를 검사하고 간식이나 음식을 사용하여 구충 치료를 제공하는 것을 가능하게 했습니다. 그림 3A 및 그림 3B 는 각각 T. canis 및 Ancylostoma spp.의 알을 보여주며, 현장 환경에서 부유 용액과 기술을 수행한 후 관찰되었습니다. 신선한 대변 샘플이 현장 환경에서 부유선광법을 적용받았을 때, 음료수 병에 준비된 용액은 기생충 알을 부유선광으로 가져올 수 있었습니다. 소금 결정과 기포의 생성은 실험실 환경에서 판독한 샘플과 비교되었으며 작업자는 차이를 감지하지 못했습니다. 이러한 관찰은 분변 샘플의 농도가 보다 정확한 현미경 판독을 보장한다는 지식에 도전하는 고무적인 결과입니다.
부유 용액과 대변 샘플을 실험실 환경에서 처리했을 때, 기생충의 현장 및 실험실 copromicroscope 검출 모두에서 동일한 양의 파편이 동시에 떠 있었기 때문에 현미경으로 판독 한 판독 값의 형태 및 선명도와 관련하여 차이가 감지되지 않았습니다. 그림 3A,B 는 도시, 교외 및 농촌 지역에서 검체를 운송한 후 완비된 실험실 환경에서 처리된 257개의 검체에서 각각 T. canis 와 Ancylostoma spp. 알을 회수한 것입니다. 이 기생충 알들은 현장 조건에서 관찰된 것들과 형태학적으로 다르지 않았다(그림 3C).
이 프로토콜은 T. canis 및 Ancylostoma spp. 유병률에서 위치, 계절, 성별, 품종, 연령 및 실외 또는 실내 조건의 영향을 평가하기에 충분한 수의 결과를 생성했습니다. 유병률 데이터는 유의 값이 0.05인 분산 분석 검정을 사용하여 비교되었습니다. 표 2는 T. canis 가 온난한 기후를 특징으로 하는 주에 비해 온대 및 건조한 기후에서 유의하게 더 높은 분포 빈도를 보인 반면, 온난, 온대 또는 건조 기후가 우세한 지역에서 Ancylostoma spp.의 유병률에는 주목할 만한 변화가 없음을 보여줍니다. 마찬가지로 Ancylostoma spp.와 T. canis 는 여름에 가장 흔하게 발견됩니다. 남성의 60.86%가 안시로스토마증 양성, 37.38%가 톡소카리아증 양성인 것으로 나타났다. 또한, T. canis 는 생후 6개월 미만의 강아지에서 더 자주 발견되었습니다. 반면 Ancylostoma spp.는 성견에서 더 많이 진단되었습니다. 흥미롭게도, 개 품종 간에 차이가 발견되지 않았다. 개 십이지장충은 실외 개의 65.54%를 감염시켰습니다. 그러나 T. canis 는 실외 또는 실내 상태의 개에서 동일하게 검출되었습니다.
그림 1: 개의 대변 샘플 수집. (A) 들개에서 대변 샘플을 채취하는 동안 주의를 기울여야 합니다. 가능하면 신선한 대변을 채취하여 실험실에서 제출 및 공동 기생충 분석을 위해 비닐 봉지에 보관해야 합니다. 샘플은 4°C에서 냉장 보관해야 하며 채취 후 24시간 이내에 스티로폼 상자 또는 절연 금속 봉투에 넣어야 합니다. (B) 대변 3g을 기준으로 권장됩니다. 따라서 2-5g이 합리적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 포화 염 용액의 준비 및 현미경 검사를 위한 분변 현탁액 처리. (A) 소금으로 만든 포화 용액의 이상적인 밀도는 1.20 이상이어야 합니다. 바닥에 결정이 없고 용액이 투명한지 확인하는 것이 좋습니다. (B) 플라스틱 여과기를 통해 분변 현탁액을 통과시키면 거친 입자가 제거됩니다. (C) 접종 루프는 오염이 없는지 확인하기 위해 화염(실험실 버너 또는 일반 휴대용 라이터)에 노출되어야 합니다. (D) 접종 루프를 식히고 현탁액 표면의 다른 부위에서 세 방울을 떨어뜨립니다. (E) 유리 슬라이드에 첫 번째 물방울을 놓은 후 물방울의 유출을 줄이기 위해 슬라이드를 움직이지 마십시오. 유리 슬라이드는 샘플을 관찰할 수 있는 얇고 투명한 플랫폼을 제공합니다. (F) 유리 슬라이드 중앙에 두 번째 물방울을 놓습니다. 분변 현탁액의 표면에서 두 번째 방울을 떨어뜨리면 기생 구조가 고르지 않게 분포되어 있을 수 있는 현탁액에서 알을 찾을 확률이 높아집니다. (G) 세 번째 물방울을 유리 슬라이드에 놓습니다. 배설물 현탁액의 표면에서 세 번째 방울을 떨어뜨리면 떠다니는 알이 집중되었을 수 있는 다른 영역을 관찰할 수 있습니다. (H) 세 방울은 분변 현탁액 표면의 다른 영역에서 선충 알을 감지하기 위해 유리 슬라이드에서 별도로 관찰됩니다. (I) 10x 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 샘플을 관찰합니다. 대물렌즈가 40x로 변경되면 대변 현탁액 방울에 커버 슬립을 놓습니다. 액적에서 양성 결과가 관찰되면 십자(+)를 할당하여 분변 현탁액 표면의 임의의 부위에 특허 기간 동안 기생충의 존재를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 40배 배율을 사용하여 광학 현미경으로 검출한 Toxocara canis 와 Ancylostoma spp.의 알. (A) 40배 배율을 사용하여 광학 현미경으로 검출된 Toxocara canis의 알. 부유선광 방법을 사용하면 거친 물질이 없는 깨끗한 현미경 필드를 시각화할 수 있습니다(현장 설정에서 수집). 부유 용액의 제조 방법에 관계없이, 알은 볼 수 있었고 주로 형태 학적 변화없이 관찰되었습니다. (B) 40배 배율을 사용하여 광학 현미경으로 검출된 Ancylostoma spp.의 알. (현장 환경에서) 대변의 농도를 수행하지 않았음에도 불구하고, 간단한 부유선광법은 현재의 방법에 따라 절차를 수행했을 때 대변에서 난자의 형태학적 검출의 단점을 해결했습니다. (C) T. canis 및 Ancylostoma spp.의 알은 40x 배율을 사용하여 광학 현미경으로 검출되었습니다. 이 난자(실험실 환경에서 회수)의 형태학적 특징은 대변 샘플의 농도가 수행되지 않았음에도 불구하고 명확했으며 현장 환경에서 회수된 난자와 다르지 않았습니다. 스케일 바 = 75 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| Ancylostoma 종. | 톡소카라 카니스 | ||
| 기후 | 온난한 기후 | 38.66암페어 | 22.52암페어 |
| 건조한 기후 | 29.41암페어 | 36.03암페어 | |
| 온화한 기후 | 31.93암페어 | 41.44비 | |
| 봄 | 23.76암페어 | 19.81암페어 | |
| 여름 | 49.81비 | 50.00b | |
| 가을 | 17.52암페어 | 20.27암페어 | |
| 겨울 | 8.88다씨 | 9.90씨 | |
| 성별 | 남성 | 60.86암페어 | 62.61암페어 |
| 여성 | 39.13비 | 37.38b | |
| 연령 | 0-3 개월 | 18.72암페어 | 51.80암페어 |
| 3-6개월 | 15.48암페어 | 32.43비 | |
| > 6개월 | 22.44암페어 | 10.36씨 | |
| > 1년 | 43.33비 | 5.40씨 | |
| 품종 | 잡종 | 52.78암페어 | 55.86암페어 |
| 순종의 | 47.22암페어 | 44.14암페어 | |
| 주거 상태 | 실내 | 34.45암페어 | 52.25암페어 |
| 야외 | 65.54암페어 | 47.74b |
표 2: 기후, 계절, 성별, 연령, 품종 및 주거 상태에 따른 4년 동안 멕시코의 개에서 Ancylostoma spp. 및 Toxocara canis의 유병률(%). 데이터의 징후는 따뜻하거나 온화하거나 건조한 기후를 특징으로 하는 지역에서 Ancylostoma spp.의 유병률에 큰 차이가 없음을 보여줍니다. 대조적으로, T. canis 는 따뜻한 기후에 비해 온화하고 건조한 기후에서 현저히 높은 유병률을 보입니다. 또한 Ancylostoma spp.와 T. canis는 여름철에 가장 자주 확인됩니다. 데이터 분석 결과, 수컷 개의 60.86%가 안시로스토미아증 양성 반응을 보인 반면, 37.38%는 톡소카리아증 양성 반응을 보였다. 또한, T. canis 는 생후 6개월 미만의 강아지에서 더 흔하게 발견되는 반면, Ancylostoma spp.는 성견에서 더 흔합니다. 흥미롭게도, 다양한 개 품종들 사이에서 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다. 연구 결과에 따르면 실외 개의 65.54%가 개 십이지장충에 감염된 반면 T. canis 는 실내 및 실외 개 사이에서 똑같이 널리 퍼져 있습니다. *요인(기후, 계절, 성별, 연령, 품종 및 주택) 다음에 동일한 문자가 오는 열 내의 평균값은 ANOVA 검정에 따라 P < 0.05에서 크게 다르지 않습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T. canis 및 Ancylostoma spp.와 같은 선충은 개의 소장에 서식할 수 있으며 인간에게 전염될 가능성이 있습니다. T. canis로 인한 임상 징후는 어린 개에게 심각하며, 성장 부진, 호흡기 문제 또는 소화관 병변으로 나타난다28. 성견의 경우 감염은 일반적으로 경미한 경향이 있습니다. 진단은 대변 샘플에서 특징적인 난자를 식별하는 데 의존합니다. 이 질환은 개에게 구충제를 처방하는 빈번한 원인이다29. 톡소카라의 역학을 이해하려면 이 기생충이 출생 전 태반을 통해 어미로부터 강아지에게 전염될 수 있으며, 새끼를 낳은 직후 은하 감염으로 젖을 먹으면서 전염될 수 있다는 사실을 인식하는 것이 중요합니다. 인간은 감염된 알을 섭취할 때 T. canis에 감염될 수 있으며, 이는 오염된 토양이나 감염된 개의 털과 같은 다양한 수단을 통해 발생할 수 있습니다. 이 경우 인간은 기생충 숙주 역할을 하며 기생 번식은 없지만 알에서 방출된 유충은 특히30세 어린이의 경우 잠재적으로 해를 끼칠 수 있습니다.
개의 십이지장충 Ancylostoma spp.에 감염되는 것은 동물이 유충을 섭취하거나 유충이 피부를 뚫고 들어갈 때 발생합니다. 강아지는 파라텐 숙주를 섭취하거나 젖산 경로(lactogenic pathway)(31)를 통해 감염될 수 있다. 성숙한 십이지장충은 피를 먹고 살며, 특히 어린 개에게 심각한 빈혈과 위장 증상을 유발할 수 있습니다. 피부를 통해 발생하는 감염은 피부염을 유발하며, 일반적으로 감염 시작 후 약 일주일 후에 해결됩니다. 다양한 구충제가 사용되었으며, 보조 요법도 병행되었다. 그러나 구충제 내성에 대한 보고가 있었습니다. 안시로스종 은 인간에게 병원성이 될 가능성이 있습니다. L3 유충의 경피적 전염은 피부 유충 편두통으로 알려진 상태로 이어질 수 있습니다. 이러한 병변은 일반적으로 치료 없이 몇 개월이 지나면 해결됩니다. 드문 경우지만, 개 십이지장충은 인간의 위장관으로 이동하여 호산구성 장염을 유발할 수 있다30.
개의 기생충에 대한 정확하고 경제적이며 신속한 진단은 개 기생충에 대한 역학적 지식을 높이는 데 필수적입니다. 이러한 이유로, 우리는 T. canis 와 Ancylostoma spp를 검출하기 위해 현장 환경에서 사용할 수 있는 단순 부유 기술의 프로토콜을 채택했습니다. 현재 프로토콜에서 직면한 관련 문제는 들개에서 샘플을 수집하는 것인데, 이러한 동물은 일반적으로 다루기 어렵기 때문입니다. 따라서 표본 채취는 개가 배변할 때까지 관찰하고 따라가는 방식으로 이루어졌기 때문에 표본 채취 방법은 시간이 많이 걸리고 까다로우며 다소 위험했습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 보호소 개에 대한 기생충학적 연구를 평가할 것을 강력히 권장한다.
인수공통전염병 기생충 난자 회수와 관련하여, 정성적 코프로시경은 진단 목적으로 기생충학 실험실에서 일반적으로 사용되는 방법론이다1. 이전 연구에서는 포화 염 용액을 사용하는 부유 선광 기술이 직접 현미경 검사보다 더 신뢰할 수 있다는 것을 발견했습니다. 예를 들어, Dryden과 공동 연구자들은 부유 선광 기법으로 처리한 206개의 분변 샘플에서 Ancylostoma spp. 알에 대해 95.15%의 민감도를 측정하고 직접 현미경 검사로 27.18%의 민감도를 측정했습니다32. 부유 용액의 밀도가 부유 방법(14,20,23)에 중요한 요소라는 것이 인정된다. 해당 밀도에 도달하지 않는 용액에서는 기생 형태가 뜨는 데 시간이 더 오래 걸리거나 전혀 뜨지 않습니다. 부유 용액이 과포화 상태이면 몇 분 안에 결정화되며 커버 슬립을 배치하면 더 일찍 결정화됩니다20.
이 프로토콜에서 부유 선광 솔루션의 선택은 준비 용이성, 편의성, 비용 및 환경 영향을 기반으로 했습니다. 설탕 용액이 결정화되는 데 시간이 더 오래 걸리더라도 포르말린 또는 페놀을 방부제로 첨가하여 끈적거리거나 끈적거리는 느낌을 줄여야 합니다. 이는 본 연구에서 우세한 현장 조건 하에서 불편한 점이다. 또한 화학 시약의 폐기는 환경 규제로 인해 복잡한 문제입니다. 이 연구의 데이터는 부유 용액을 준비하고 끓일 수 있는 실험실 장비의 가용성이 부족하기 때문에 소다병을 사용하여 현장 조건에서 일반 식염으로 준비된 포화 용액이 실험실 환경에서 준비된 것만큼 효과적임을 보여주었습니다. 유일하게 눈에 띄는 차이점은 투명한 용액이 보일 때까지 음료수 병을 흔드는 데 걸리는 시간이 더 길다는 것입니다. 현미경 관찰은 포화 용액을 준비하기 위해 두 가지 방법을 모두 사용하여 준비된 샘플에 대해 동일하게 깨끗했습니다. 앞서 언급한 진술을 확인하기 위해 앞으로 더 많은 수의 샘플로 더 많은 연구를 수행하는 것이 중요합니다. 그러나 시간이 많이 걸리고 몇 시간 동안 병 안의 용액을 흔드는 물리적 노력이 필요합니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 배설물이 표면에 떠서 농축될 수 있도록 분변 현탁액을 최소 15분 동안 그대로 두는 것입니다. 그러나 휴식 시간이 길수록 더 많은 파편이 떠다니고 몇 시간 후에 알이 변형되거나 깨집니다. 공기생충 투시경 방법의 민감도와 특이도가 낮고 진단 검사로서의 이러한 방법의 정확도는 사용자의 기술에 달려 있다는 점을 고려하여 본 연구에서는 훈련되고 경험이 풍부한 기생충학자가 부유 선광 기술을 수행하고 기생충을 식별했습니다.
우리가 아는 한, 이 연구는 현장 환경에서 간단한 부유 선광 방법으로 검사한 분변 샘플을 사용하여 멕시코의 개에서 Ancylostoma spp. 및 T. canis 의 유병률을 추정한 최초의 연구입니다. 우리가 사용한 부유선광 기법은 수십 년 동안 사용되어 왔음에도 불구하고 여전히 매우 효과적이고 경제적이며 신속한 진단 테스트라는 것이 입증되었습니다14. 그럼에도 불구하고 개 기생충 진단에 사용한 것보다 더 높은 민감도와 특이도를 가진 공기생경 기술이 있습니다. 파우스트 기법의 경우와 같이 침전 농도와 같은. 또한, 농축 방법인 파우스트는 Giardia33과 같은 원생동물의 검출에도 더 효과적인 것으로 나타났다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그럼에도 불구하고 본 연구를 위해 선택한 공호흡경 방법은 비용과 같은 몇 가지 장점이 있었다. 파우스트 기술은 원심분리기와 같은 고가의 추가 장비가 필요하기 때문에 식염수 포화 용액을 사용한 부유선광보다 비용이 많이 듭니다. 황산아연과 같은 시약을 사용하는 것과 같은 다른 농축 방법은 일반 소금보다 비싸고 원심분리기에서 필요한 세척 횟수로 인해 더 많은 시간이 필요합니다. 따라서 Faust 기술은 원심 분리기에 대한 접근이 일반적이지 않은 현장 작업에서 사용하기에 제한적입니다.
가장 중요한 것은 단순 부유 선광 기술의 한계는 크립토스포리디움 난포낭, 편모충 낭종 또는 트리추리스 알을 검출할 만큼 민감하지 않다는 것입니다. 따라서 기생충 형태를 농축하기 위해 원심 분리 절차를 사용하는 기술은 이러한 종의 진단을 의도하는 경우 사용되어야 합니다. 본 연구에서 보고된 속의 양성률이 표본추출 전략으로 편의방법을 사용했기 때문에 결정적인 것으로 간주되어서는 안 된다는 점을 강조하는 것은 의미가 있다. 동물 관리가 어려운 보호소와 같이 개의 기생충을 식별하는 것이 중요한 상황이 있을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 결과적으로, 이 프로토콜은 결합된 샘플의 수집을 수용하기 위해 향후 조정이 필요할 수 있습니다.
약점으로, 간단한 부유선광법과 NaCl의 포화용액의 제조는 주로 현장 조건에서 개의 배설물을 검사하기 위한 특정 목적을 위해 개발되었지만, 단순 부유선광 절차의 민감도는 일반적으로 낮은 것으로 간주되어 왔다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 더 무거운 기생충 종의 낭종이나 알을 검출하려면 농축 기술을 사용하는 것이 좋습니다. 단순 부유선광법의 낮은 민감도를 감안할 때, 현장이나 실험실 환경에서 수행되는지 여부에 관계없이 이 기술이 개 기생충의 역학 연구를 위한 선택 방법으로 유용할지 의심하는 것이 합리적이었습니다. 그럼에도 불구하고, 이 연구에서 개에서 높은 Ancylostoma spp. 유병률과 T. canis 알의 검출은 현장 또는 실험실 환경에서 수행되는 간단한 부유 선광 방법이 추가 역학 연구를 뒷받침하고 이러한 선충에 대한 개와 인간의 감염을 줄이기 위한 통제 및 예방 조치를 제안할 수 있는 증거를 제공하는 데 유용하다는 것을 나타냅니다.
단순 부유선광법을 이용하여 개의 배설물에서 T. canis와 Ancylostoma spp. 난자 회복에 영향을 미치는 요인을 분석하였다. T. canis의 발견은 기생충이 온대와 열대 지역에서 현저히 더 널리 퍼져 있음을 나타내는 최신 연구와 일치합니다. 이는 환경적 요인, 특히 기온과 강우량이 기생충 종의 생태학적 범위에 어떻게 영향을 미치는지를 조사한 선행 연구와 일치한다 34,35,36. 현재 결과는 두 기생충 모두 수컷을 감염시키는 비율이 훨씬 더 높다는 것을 보여주었습니다. 이 발견은 남성이 면역학적으로 감염에 덜 반응하기 때문이라고 추측하는 것이 합리적이다37,38. 나이는 T. canis의 유병률에 영향을 미치는데, 강아지가 이 기생충의 영향을 더 많이 받았기 때문입니다. 이 발견은 이 기생충이 강아지에게 더 큰 영향을 미치는 경향이 있는 반면, 성충은 내성이 증가하여 감염 가능성이 낮다는 이전 연구와 일치합니다 6,39. 교배견과 순종견 모두 톡소카라 카니스(Toxocara canis)와 안시로스토마(Ancylostoma spp)의 유병률이 비슷했다. 그러나 들개는 가정에 거주하는 개에 비해 Ancylostoma spp.의 유병률이 더 높았습니다. 이 결과는 개 품종 간의 차이를 발견하지 못한 이전 보고서와 일치하지 않는다6. 포화 식염수 제조 및 이 프로토콜에 사용된 간단한 부유 선광 방법의 향후 적용은 현장 또는 실험실 조건에서 일상적인 대변 검사를 위해 수행될 수 있다는 결론을 내릴 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 PAPIIT IN218720 보조금을 통해 재정 자원을 제공한 Universidad Nacional Autónoma de México의 Dirección General de Asuntos del Personal Académico와 요청된 연장을 승인한 Dr. Claudia Mendoza에게 감사를 표합니다. 이 작품은 2019년에 세상을 떠난 사랑스러운 니콜에게 바칩니다. 당신은 항상 내 마음 속에 살 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
References
- Duncan, K. T., Koons, N. R., Litherland, M. A., Little, S. E., Nagamori, Y. Prevalence of intestinal parasites in fecal samples and estimation of parasite contamination from dog parks in central Oklahoma. Veterinary Parasitology Regional Studies and Reports. 19, 100362 (2020).
- Kisiel, L. M., et al. Owned dog ecology and demography in Villa de Tezontepec, Hidalgo, Mexico. Preventive Veterinary Medicine. 135, 37-46 (2016).
- Lyons, M. A., Malhotra, R., Thompson, C. W. Investigating the free-roaming dog population and gastrointestinal parasite diversity in Tulúm, México. PLoS One. 17 (10), e0276880 (2022).
- Dantas-Torres, F., et al. TROCCAP recommendations for the diagnosis, prevention and treatment of parasitic infections in dogs and cats in the tropics. Veterinary Parasitology. 283, (2020).
- Cantó, G. J., García, M. P., García, A., Guerrero, M. J., Mosqueda, J. The prevalence and abundance of helminth parasites in stray dogs from the city of Querétaro in central Mexico. Journal Of Helminthology. 85 (3), 263-269 (2011).
- Torres-Chablé, O. M., et al. Prevalence of gastrointestinal parasites in domestic dogs in Tabasco, Southeastern Mexico. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 24 (4), 432-437 (2015).
- Cortez-Aguirre, G. R., Jiménez-Coello, M., Gutiérrez-Blanco, E., Ortega-Pacheco, A. Stray dog population in a city of Southern Mexico and its impact on the contamination of public areas. Veterinary Medicine International. 2018, 1-6 (2018).
- Rodríguez-Vivas, R. I., et al. An epidemiological study of intestinal parasites of dogs from Yucatán, Mexico, and their risk to public health. Vector Borne Zoonotic Diseases. 11 (8), 1141-1144 (2011).
- Maggi, R. G., Krämer, F. A review on the occurrence of companion vector-borne diseases in pet animals in Latin America. Parasites & Vectors. 12 (1), 145 (2019).
- Cruz-Vazquez, C., Castro, G., Parada, F., Ramos, P. Seasonal occurrence of Ctenocephalides felis and Ctenocephalides canis (siphonaptera:Pulicidae) infesting dogs and cats in an urban area in Cuernavaca, Mexico. Entomological Society of America. 38 (1), 111-113 (2001).
- Bolio-Gonzalez, M. E., et al. Prevalence of the Dirofilaria immitis infection in dogs from Mérida, Yucatán, Mexico. Veterinary Parasitology. 148 (2), 166-169 (2007).
- Pastor-Santiago, J. A., Flisser, A., Chávez-López, S., Guzmán-Bracho, C., Olivo-Díaz, A. American visceral leishmaniasis in Chiapas, Mexico. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86 (1), 108-114 (2012).
- Trasviña-Muñoz, E., et al. Detection of intestinal parasites in stray dogs from a farming and cattle region of Northwestern Wexico. Pathogens. 9 (7), (2020).
- Ballweber, L. R., Beugnet, F., Marchiondo, A. A., Payne, P. A. American Association of Veterinary Parasitologists' review of veterinary fecal flotation methods and factors influencing their accuracy and use--is there really one best technique. Veterinary Parasitology. 204 (1-2), 73-80 (2014).
- Nielsen, M. K. What makes a good fecal egg count technique. Veterinary Parasitology. 296, 109509 (2021).
- Gordon, H. M., Whitlock, H. V. A new technique for counting nematode eggs in sheep faeces. Journal of the Council for Scientific and Industrial Research. 12 (1), 50-52 (1939).
- O'grady, M. R., Slocombe, J. O. D. An investigation of variables in a fecal flotation technique. Canadian Journal of Comparative Medicine. 44 (2), 148 (1980).
- ESCCAP. Worm control in dogs and cats. Guideline 01. European Scientific Counsel Companion Animal Parasites. , (2017).
- Cringoli, G., et al. Ancylostoma caninum: Calibration and comparison of diagnostic accuracy of flotation in tube, McMaster and FLOTAC in faecal samples of dogs. Experimental Parasitology. 128 (1), 32-37 (2011).
- Figueroa, C. J. A. Examen coproparasitoscópico. In: Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria, Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal. AMPAVE-CONASA. , 83-105 (2015).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Adolph, C., et al. Diagnostic strategies to reveal covert infections with intestinal helminths in dogs. Veterinary Parasitology. 247, 108-112 (2017).
- Cringoli, G., Rinaldi, L., Maurelli, M. P., Utzinger, J. FLOTAC: New multivalent techniques for qualitative and quantitative copromicroscopic diagnosis of parasites in animals and humans. Nature Protocols. 5 (3), 503-515 (2010).
- Katagiri, S., Oliveira-Sequeira, T. C. Comparison of three concentration methods for the recovery of canine intestinal parasites from stool samples. Experimental Parasitology. 126 (2), 214-216 (2010).
- Rehbein, S., Lindner, T., Visser, M., Winter, R. Evaluation of a double centrifugation technique for the detection of Anoplocephala eggs in horse faeces. Journal of Helminthology. 85 (4), 409-414 (2011).
- Liccioli, S., et al. Sensitivity of double centrifugation sugar fecal flotation for detecting intestinal helminths in coyotes (Canis latrans). Journal of Wildlife Diseases. 48 (3), 717-723 (2012).
- Rishniw, M., Liotta, J., Bellosa, M., Bowman, D., Simpson, K. W. Comparison of 4 Giardia diagnostic tests in diagnosis of naturally acquired canine chronic subclinical giardiasis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 24 (2), 293-297 (2010).
- Barutzki, D., Schaper, R. Endoparasites in dogs and cats in Germany 1999-2002. Parasitology Research. 90, S148-S150 (2003).
- Carlin, E. P., Tyungu, D. L. Toxocara: Protecting pets and improving the lives of people. Advances in Parasitology. 109, 3-16 (2020).
- Saari, S., NaReaho, A., Nikander, S. Canine parasites and parasitic diseases. , Academic Press. (2019).
- Bowman, D. D., Montgomery, S. P., Zajac, A. M., Eberhard, M. L., Kazacos, K. R. Hookworms of dogs and cats as agents of cutaneous larva migrans. Trends in Parasitology. 26 (4), 162-167 (2010).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Barutzki, D., Schaper, R. Results of parasitological examinations of faecal samples from cats and dogs in Germany between 2003 and 2010. Parasitology Research. 109, S45-S60 (2011).
- Novobilský, A., Novák, J., Björkman, C., Höglund, J. Impact of meteorological and environmental factors on the spatial distribution of Fasciola hepatica in beef cattle herds in Sweden. BMC Veterinary Research. 11, 128 (2015).
- Pickles, R. S., Thornton, D., Feldman, R., Marques, A., Murray, D. L. Predicting shifts in parasite distribution with climate change: A multitrophic level approach. Global Change Biology. 19 (9), 2645-2654 (2013).
- Pérez-Rodríguez, A., De La Hera, I., Fernández-González, S., Pérez-Tris, J. Global warming will reshuffle the areas of high prevalence and richness of three genera of avian blood parasites. Global Chaneg Biology. 20 (8), 2406-2416 (2014).
- Nava-Castro, K., Hernández-Bello, R., Muñiz-Hernández, S., Camacho-Arroyo, I., Morales-Montor, J. Sex steroids, immune system, and parasitic infections: Facts and hypotheses. Annals Of The New York Academy Of Sciences. 1262, 16-26 (2012).
- Morales-Montor, J., Escobedo, G., Vargas-Villavicencio, J. A., Larralde, C. The neuroimmunoendocrine network in the complex host-parasite relationship during murine cysticercosis. Current Topics in Medicinal Chemistry. 8 (5), 400-407 (2008).
- Olave-Leyva, J., et al. Prevalencia de helmintos gastrointestinales en perros procedentes del servicio de salud de Tulancingo, Hidalgo. Abanico Veterinario. 9 (1), 1-10 (2019).
