Summary
Dit werk beschrijft het gebruik van een flotatiemethode om Toxocara canis en Ancylostoma spp. gedetecteerd in fecale monsters verzameld van honden in Mexico van 2017 tot 2021 onder veldomstandigheden.
Abstract
Diagnose van hondenparasieten met zoönotisch potentieel, zoals Toxocara canis en Ancylostoma caninum onder veldomstandigheden, is meestal moeilijk vanwege de beperkte toegang tot een laboratorium in landelijke en voorstedelijke gebieden in Mexico. Deze studie had tot doel T. canis en Ancylostoma spp. te detecteren in fecale monsters verzameld van honden in Mexico van 2017 tot 2021 onder veldomstandigheden. De berekening van de steekproefomvang resulteerde in een beoogde inschrijving van 534 honden in het hele land.
Monsters werden na de ontlasting rechtstreeks uit het rectum of de grond verzameld. De monsters werden bewaard in afzonderlijke, goed afgesloten plastic zakken bij 4 °C. Een verzadigde oplossing van natriumchloride (soortelijk gewicht [SpG] 1,20) werd zowel onder veld- als laboratoriumomstandigheden bereid. Binnen 3 dagen na afname werd 2-4 g ontlasting getest op parasieten met behulp van een flotatiemethode door elk fecaal monster in een zoutoplossing te suspenderen. Uitwerpselen werden gemengd met de flotatieoplossing en geplet met een metalen lepel.
Zodra een uniforme consistentie was bereikt, werd het fecale monster met behulp van een zeef in een nieuwe plastic beker gegoten en 10-15 minuten laten staan. Drie druppels van de bovenkant van het mengsel werden opgevangen met behulp van een gesteriliseerde inoculatielus. De objectglaasjes werden op de microscoop gelegd en parasieten werden geïdentificeerd door getrainde parasitologen. Fecale monsters van 1.055 honden werden microscopisch gescreend. Het aantal positieve monsters voor Ancylostoma spp. was 833 (78,95% frequentie) en 222 (21,04%) voor T. canis. Deze bevindingen illustreren het belang van het identificeren van zoönotische wormen bij honden die in stedelijke en landelijke gebieden in Mexico leven met behulp van een coproparasitoscopische techniek in het laboratorium en onder veldomstandigheden.
Introduction
Gastro-intestinale parasieten zijn een van de meest voorkomende gezondheidsproblemen bijhonden1. Schattingen suggereren dat er wereldwijd ~700 miljoen gedomesticeerde honden zijn, en ongeveer 175 miljoen kunnen worden gecategoriseerd als vrij rondlopend2. Meer dan 60 soorten parasieten worden gedeeld tussen honden en mensen, wat suggereert dat honden een bron van infectie kunnen zijn voor mensen met deze parasieten. Toxocara canis en Ancylostoma caninum zijn twee parasitaire soorten die honden en, per ongeluk, menselijke gastheren infecteren. Momenteel zijn er verschillende onderzoeken naar de locaties waar deze wormen kunnen overleven en zich kunnen voortplanten in Mexico. De prevalentie van Toxocara bij honden varieert van 0% tot meer dan 87% in de Verenigde Staten, Mexico, Midden-Amerika en het Caribisch gebied4. Toxocara canis en Ancylostoma spp., evenals andere parasitaire soorten bij honden, zijn eerder gerapporteerd in Mexico 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabel 1).
| Parasitaire soorten | Regio | Prevalentie (%) | Referentie |
| Caninum van Ancylostoma | Kanton Querétaro | 42.90 | 5 |
| Tabasco | 15.90 | 6 | |
| Campeche | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| Yucatán | 73.8 | 8 | |
| Babesia | Morelos | 13.60 | 9 |
| Veracruz | 10.00 | ||
| Coccidiale oöcysten | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Ctenocfaliden | Morelos | 30.3 | 10 |
| Dipylidium caninum | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Dirofilaria | Yucatán | 7.0 – 8.3 | 11 |
| Giardia | Tabasco | 3.00 | 6 |
| Yucatán | 18.8 | 8 | |
| Leishmania | Chiapas | 19.00 | 12 |
| Lintwormen | Baja Californië | 6.79 | 13 |
| Canis van Toxocara | Kanton Querétaro | 22.10 | 5 |
| Yucatán | 6.20 | 8 | |
| Vulpis van Trichuris | Yucatán | 25.40 | 8 |
| Trypanosoma | Jalisco | 8.10 | 9 |
| Campeche | 7.60 | ||
| Chiapas | 4.5 – 42.8 | ||
| Quintana Roo | 20.1 – 21.3 | ||
| Toluca | 17.50 | ||
| Yucatán | 9.8 – 34 |
Tabel 1: Regionale prevalentie (%) van hondenparasieten in Mexico van 2001 tot 2020. Bevindingen van eerdere onderzoeken die van 2001 tot 2020 zijn uitgevoerd, hebben de identificatie van de verspreiding van hondenparasieten in verschillende stedelijke en landelijke omgevingen in Mexico mogelijk gemaakt. Deze studies bieden een diepgaand inzicht in epidemiologische elementen die bevorderlijk zijn voor de persistentie van hondenparasieten in verschillende ecosystemen, en dragen bij aan een uitgebreide beoordeling van de zoönotische impact van sommige parasietsoorten.
Levenscyclusstadia van darmparasieten, zoals eieren, cysten, oöcysten of larven, zijn te vinden in ontlastingsmonsters. Onderzoek van fecaal materiaal levert dus waardevolle informatie op over de parasieten van een dier. De behoefte aan een methode om Ancylostomidae-eieren in menselijke uitwerpselen te detecteren, leidde in 1878 tot het gebruik van het eenvoudige uitstrijkje, dat jarenlang werd gebruikt om gastro-intestinale parasieten op te sporen, maar als niet erg gevoelig werd beschouwd. Zo ontstond de behoefte om betere copromicroscopische methoden te ontwikkelen14. Er zijn meer dan 100 jaar verstreken sinds de flotatietechniek voor het herstellen en tellen van parasieteneieren in fecale monsters voor het eerst werd beschreven15. Sindsdien worden verschillende methoden en varianten van de flotatietechniek beschouwd als een standaard voor de detectie van sommige parasieten in hun gastheren.
Zo beschreef Lane in 1924 een methode met de directe centrifugale flotatietechniek, waarbij centrifugatie wordt geïntegreerd gevolgd door het drijven van het sediment in een verzadigde natriumchloride-oplossing met SpG 1,2 in 1 g (Lane) of 10 g (Stoll's modificatie). De flotatietechniek werd vervolgens aangepast door gebruik te maken van oplossingen met verschillende SpG14. In 1939 rapporteerden Gordon en Whitlock de nadelen van de techniek van Stoll als gevolg van interferentie van afval bij het visualiseren van parasieteneieren en ontwikkelden ze de kwantitatieve methode die bekend staat als McMaster16. In 1979 toonden O'Grady en Slocombe aan dat het soortelijk gewicht van de oplossing, timing en maaswijdten van zeven van invloed zijn op de nauwkeurigheid van de detectie van eieren met behulp van de flotatietechniek17. In de afgelopen decennia is er, omdat er verschillende wijzigingen zijn aangebracht in de flotatietechniek, dringend behoefte aan standaardisatie van flotatiemethoden. Momenteel is detectie van worminfecties bij honden in het kader van de preventie van zoönotische parasieten vereist om passende anthelmintische behandelingen toe te passen om milieuverontreiniging met infectieuze stadia van zoönotische nematoden te beperken18.
Van de kwalitatieve methoden wordt de fecale flotatietechniek veel gebruikt en geaccepteerd omdat er niet veel apparatuur voor nodig is, eenvoudig, goedkoop en reproduceerbaar is; Toch heeft het een groot nadeel dat het niet gevoelig is wanneer de intensiteit van de infectie laag is19. Het vermogen om de aanwezigheid van een groter aantal parasitaire elementen zoals eieren, oöcysten, cysten of nematodenlarven aan te tonen, wordt meestal bepaald door de dichtheid van de oplossing20.
In eerdere rapporten zijn coproparasitologische technieken voor de detectie van eitjes van hondenaaltjes vergeleken. Met betrekking tot de detectie van beweeglijke protozoa worden directe fecale uitstrijkjes gebruikt; terwijl sedimentatiemethoden nuttig zijn voor het diagnosticeren van zware eieren van parasieten zoals trematoden21. Een van de meest gebruikte diagnostische tests in het veld is de fecale uitstrijkmethode. Het lage gevoeligheidsniveau van deze techniek kan echter worden toegeschreven aan het feit dat het puin bevat dat de detectie van parasieteneieren verstoort. Door een zeefstap op te nemen in combinatie met oplossingen die de juiste SpG bieden, biedt de flotatiemethode een duidelijkere en minder rommelige observatie van ascarid- en haakwormeieren. Dit leidt tot een nauwkeuriger en efficiënter proces voor microscopische screening22. Evenzo worden eenvoudige flotatie- en directe centrifugale flotatietechnieken zeer vaak gebruikt om parasieteneieren en oöcysten teherstellen14. De klassieke flotatiemethoden kunnen als kwalitatief of kwantitatief worden beschouwd, afhankelijk van het gebruik van een telkamer zoals de McMaster-methode15. Aangezien de flotatietechniek echter een lage gevoeligheid heeft en zich richt op de detectie van parasieten tijdens de octrooiperiode, mogen negatieve resultaten niet als overtuigend worden beschouwd. De nauwkeurigheid hangt echter niet alleen af van de conserveringsprocedure van fecale monsters of de SpG van flotatieoplossingen, maar hangt ook af van de technische vaardigheid en ervaring met het uitvoeren van fecale onderzoeken van de gebruiker.
Daarom zijn andere methoden onderzocht voor de detectie van hondenparasieten in ontlasting. Het is algemeen erkend dat een van de meest gebruikte benaderingen voor de diagnose van intestinale worminfecties bij honden de FLOTAC-techniek is, een multivalente, gevoelige en nauwkeurige methode die nauwkeurige en betrouwbare resultaten oplevert voor de diagnose van A. caninum bij honden in vergelijking met een flotatieprotocol in een buis en de McMaster-techniek19, 23. okt. Sedimentatiemethoden zijn nuttig voor het terugwinnen van boteieren, bevruchte nematodeneieren en de meeste lintwormeieren, die niet kunnen worden teruggevonden op het oppervlak van een flotatieoplossing omdat deze structuren niet drijven24. Een methode waarvan is bewezen dat deze superieur is aan flotatie-/sedimentatietechnieken is de gemodificeerde dubbele centrifugale flotatiemethode, omdat deze de detectie van cestode-eieren in uitwerpselen mogelijk maakt, minder tijdrovend is, Anoplocephala-eieren scheidt van fecaal afval en kristallisatie vermindert25. Bovendien is deze techniek met succes gebruikt om ascarid-eieren met een hoge gevoeligheid te detecteren26. Toch vereisen sommige van deze bovengenoemde technieken en centrifugale methoden zoals de Ovassay, in tegenstelling tot het flotatieprotocol dat we in deze studie voorstellen, monsterbewaring in reagentia zoals formaline, commerciële kits, monsterverwerking onder laboratoriumomstandigheden en het gebruik van reagentia zoals zinksulfaat27 die duur zijn en speciale verwijderingsprocedures vereisen om milieutoxiciteit te voorkomen.
Het gebruik van technieken die de gevoeligheid van de flotatiemethode verhogen door oplossingen met een hoge SpG toe te voegen, heeft de laatste tijd de voorkeur. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat het nadeel van deze oplossingen de toename van puin in de uiteindelijke bereiding is en dus de onnauwkeurige detectie van parasieteneieren. Bovendien zijn de commerciële beschikbaarheid van materialen, reagentia, kosten, milieu-impactkwesties en de moeilijkheid van het gebruik van centrifugale methoden van invloed op de selectie van een flotatietechniek14, die in veldomstandigheden een uitdaging kan zijn in tegenstelling tot het protocol dat we in dit werk presenteren. De bereiding van de flotatieoplossingen met keukenzout is voordeliger dan het gebruik van suiker, omdat suiker onder veldomstandigheden insecten zoals wespen en bijen aantrekt en preparaten plakkerig worden. Verder zijn oplossingen zoals fenol, dat wordt toegevoegd aan suikeroplossingen om plakkerigheid te voorkomen, of ZnSO4complex om op de juiste manier weg te gooien volgens de richtlijnen voor milieubescherming en kunnen ze niet in het veld worden weggegooid; in tegenstelling tot een keukenzoutoplossing.
Het doel van dit manuscript is om de stappen te demonstreren om T. canis en Ancylostoma spp. eieren in fecale monsters te detecteren met behulp van een aanpassing van de eenvoudige flotatietechniek onder veld- en laboratoriumomstandigheden. Volgens het hierbij beschreven protocol en met behulp van een microscoop met een back-upbatterij, is de diagnose van deze zoönotische parasieten bij honden in landelijke en voorstedelijke gebieden mogelijk wanneer er geen laboratoriumapparatuur en infrastructuur beschikbaar zijn. De eenvoudige flotatiemethode die in dit werk wordt beschreven, kan snelle resultaten opleveren en is een niet-invasieve en kosteneffectieve techniek voor routinematige screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik en de verzorging van honden is goedgekeurd door de Nationale en Autonome Universiteit van Mexico.
1. Afname van ontlastingsmonsters
NOTITIE: Behandel de hond met de hulp van een dierenarts of de eigenaar van het dier.
- In het geval van wilde honden (figuur 1A) of nerveuze dieren, verzamel monsters van de grond direct na de ontlasting of niet meer dan 10 minuten later.
- Smeer chirurgische handschoenen of dunwandige polyethyleen zakken in met water of vaseline. Om fecale monsters uit het rectum te verzamelen, draagt u chirurgische handschoenen of dunwandige polyethyleenzakken.
- Verzamel ten minste 2 g uitwerpselen van elke hond (Figuur 1B).
- Identificeer individuele ontlastingsmonsters als volgt: datum, locatie (GPS-coördinaten van het Global Positioning System [GPS] met behulp van Google Maps), wijs een identificatienummer toe voor elk dier, geschatte leeftijd van de hond, geslacht van de hond, ras, binnen- of buitenhond (wilde) hond.
- Sluit de zakken met het ontlastingsmonster met een strakke knoop. Bewaar de zakken gekoeld (4-8 °C) als de ontlastingsmonsters niet binnen 3-4 uur na afname worden geanalyseerd.
2. Bereiding van een verzadigde zoutoplossing voor velddiagnose
NOTITIE: Als de toegang tot een balans, meetmateriaal, fornuizen of gas om water te koken afwezig of beperkt is, kan de verzadigde zoutoplossing eenvoudig worden bereid met water, keukenzout, een plastic beker van 12 oz (355 ml) en een lege fles van 1 liter frisdrankplastic.
- Was een lege frisdrankfles van 1 liter grondig schoon. Vul de fles met 1 L water.
- Vul een plastic beker van 12 oz met gewoon keukenzout.
- Breng het zout over in de frisdrankfles.
- Sluit de frisdrankfles goed af met de schroefdop. Schud de oplossing krachtig totdat het zout niet meer oplost.
NOTITIE: Het schudden van de oplossing in de frisdrankfles totdat het zout volledig is opgelost, kan tot 90 minuten duren.
3. Bereiding van een verzadigde zoutoplossing voor laboratoriumdiagnose
- Weeg 420 g keukenzout af.
- Los 420 g zout op in 1 L water.
- Kook de oplossing tot er geen zout meer is opgelost.
- Filter de oplossing om het onopgeloste zout weg te gooien.
- Controleer de concentratie van de oplossing met behulp van een hydrometer of densitometer met zware vloeistof.
OPMERKING: De ideale concentratie heeft een SpG van 1,20 om betere resultaten te bereiken (Figuur 2A). Het drijvend vermogen van een ei wordt beïnvloed door de interactie met de oplossing, wat bijdraagt aan het variërende vermogen van eieren om te drijven in oplossingen met hetzelfde soortelijk gewicht. Om een optimaal herstel van de eicellen te bereiken, is het daarom essentieel om rekening te houden met het bovenste bereik van het soortelijk gewicht in de flotatieoplossing, zodat het dat van de beoogde parasietelementenovertreft 6.
4. Flotatiemethode
OPMERKING: Als fecale monsters te droog of te hard zijn, macereer ze dan in een vijzel.
- Doe met een lepel ongeveer 3 g uitwerpselen in een plastic beker (~8,5 cm hoog en ~5,5 cm in diameter).
- Voeg 1 ml van de verzadigde zoutoplossing toe tot een pasta is verkregen.
- Roer gedurende 1 minuut en voeg 100 ml verzadigde zoutoplossing toe.
- Haal deze suspensie door een plastic zeef in een tweede plastic beker om grove deeltjes te voorkomen (Figuur 2B).
- Laat de suspensie 15-20 minuten staan.
- Plaats een inoculatielus gedurende 1 s in een vlam om er zeker van te zijn dat deze vrij is van eieren, cysten of oöcysten (Figuur 2C).
- Wacht 5 s totdat de inoculatielus is afgekoeld (Figuur 2D).
- Neem drie druppels van het oppervlak van de suspensie met de inoculatielus. Plaats elk van de drie druppels afzonderlijk op één objectglaasje (Figuur 2E-G)
NOTITIE: Zorg ervoor dat de druppels niet met elkaar in contact komen (Figuur 2H). - Observeer onder de microscoop met een 10x objectief (Figuur 2I). Plaats een dekglaasje als de vergroting wordt verhoogd tot 40x.
- Wanneer een positief resultaat wordt waargenomen in de druppel, wijst u een kruis (+) toe in het laboratoriumlogboek om de aanwezigheid van parasieten in de octrooiperiode op willekeurige plaatsen van het fecale suspensieoppervlak te registreren.
5. Uitlegging van de flotatiemethode
OPMERKING: Negatieve resultaten zijn niet doorslaggevend.
- Voer een reeks van drie tests uit met monsters van 3 opeenvolgende dagen om de gevoeligheid van de test te verhogen.
OPMERKING: Positieve resultaten duiden op de aanwezigheid van parasieten in de octrooiperiode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit werk worden verzamelings- en coproparasitoscopische procedures voor de identificatie van T. canis en Ancylostoma spp. beschreven. De grondgedachte achter de aanpassing van de eenvoudige fecale flotatiemethode om wormeieren bij honden te detecteren, is dat deze techniek kosteneffectief is omdat de oplossingen, apparatuur en materialen goedkoop zijn. Daarom heeft de methode een hoge monsterverwerkingscapaciteit, aangezien meerdere monsters in korte tijd kunnen worden verwerkt. Bovendien is de eenvoudige fecale flotatiemethode gemakkelijk uit te voeren en relatief gevoelig.
De steekproefomvang en de keuze van de dieren werden gemaakt op basis van gemak, voornamelijk bepaald door de bereidheid van de eigenaar van de dieren en de veiligheid van naderende wilde honden. In het huidige werk werd de flotatiemethode gebruikt om het voorkomen en de frequentie van Ancylostoma spp. en T. canis bij honden Canis lupus familiaris in Mexico gedurende 4 jaar vanaf 2017 te beoordelen. Fecale monsters van 1.638 honden werden verzameld en microscopisch gescreend. In totaal waren 1.235 honden positief voor T. canis en Ancylostoma spp. Een van de doelen van het gebruik van de flotatiemethode was om de effectiviteit ervan aan te tonen bij het meten van het voorkomen van Toxocara of Ancylostoma, maar we wilden ook een dieper onderzoek uitvoeren naar de factoren die van invloed kunnen zijn op hun prevalentie. Als gevolg daarvan werden 185 dieren met gemengde infecties teruggegooid. Het aantal positieve monsters voor Ancylostoma spp. was 833 (78,95% frequentie) en 222 (21,04%) voor T. canis. Van de 1.050 monsters werd 75,5% (793 monsters) verwerkt en afgelezen in een veldomgeving door de flotatieoplossing te bereiden met een frisdrankfles en een microscoop te gebruiken met 3 x 1,2 V oplaadbare AA-batterijen gedurende 4 uur continu gebruik. De overige 257 fecale monsters werden in het laboratorium onderzocht.
Een doel van deze studie was om een flotatieoplossing en een methode in een veldomgeving te gebruiken om de diagnose van twee wormparasieten van honden te versnellen en te vergemakkelijken in gebieden waar geen laboratoriuminfrastructuur of -apparatuur beschikbaar is. De toepassing van de flotatiemethode in het veld stelde ons in staat om bevindingen onmiddellijk na elke microscopische meting aan 400 eigenaren te communiceren om aanbevelingen te doen met betrekking tot anthelmintische behandelingen en preventieve maatregelen en zo de verspreiding van parasieten bij mensen of gezelschapsdieren te voorkomen. Evenzo maakte de flotatietechniek in het veld het mogelijk om wilde honden te onderzoeken en hen een anthelmintische behandeling te geven met traktaties of voedsel. Figuur 3A en Figuur 3B tonen eieren van respectievelijk T. canis en Ancylostoma spp., waargenomen nadat de flotatieoplossing en -techniek in een veldomgeving waren uitgevoerd. Wanneer verse ontlastingsmonsters werden onderworpen aan de flotatiemethode in een veldomgeving, was de oplossing bereid in een frisdrankfles in staat om wormeieren in flotatie te brengen. De productie van zoutkristallen en luchtbellen werd vergeleken met de monsters die in een laboratoriumomgeving werden afgelezen en er werd geen verschil gedetecteerd door de operator. Deze observatie is bemoedigend en daagt de wetenschap uit dat de concentratie van fecale monsters een nauwkeurigere microscopische meting garandeert.
Wanneer de flotatieoplossing en de ontlastingsmonsters in een laboratoriumomgeving werden verwerkt, werd er geen verschil waargenomen met betrekking tot de morfologie en helderheid van de metingen onder de microscoop, aangezien dezelfde hoeveelheid puin gelijktijdig dreef in zowel het veld als de copromicroscopische detectie van parasieten in het laboratorium. Figuur 3A,B toont respectievelijk T. canis en Ancylostoma spp. eieren, teruggevonden uit de 257 monsters die werden verwerkt in een volledig uitgeruste laboratoriumomgeving na transport van monsters uit stedelijke, voorstedelijke en landelijke gebieden. Deze parasieteneieren verschilden morfologisch niet van de eieren die onder veldomstandigheden werden waargenomen (Figuur 3C).
Dit protocol leverde een voldoende aantal bevindingen op om de invloed van locatie, seizoen van het jaar, geslacht, ras, leeftijd en buiten- of binnenomstandigheden in de prevalentie van T. canis en Ancylostoma spp. te beoordelen. Prevalentiegegevens werden vergeleken met behulp van de ANOVA-test met een significantiewaarde van 0,05. Tabel 2 laat zien dat T. canis een significant hogere verspreidingsfrequentie vertoonde in gematigde en droge klimaten in vergelijking met staten die worden gekenmerkt door warme klimaten, terwijl er geen noemenswaardige variatie was in de prevalentie van Ancylostoma spp. in regio's met overwegend warme, gematigde of droge klimaten. Evenzo worden Ancylostoma spp. en T. canis het vaakst gedetecteerd in de zomer. Het bleek dat 60,86% van de mannen positief was voor ancylostomiasis en 37,38% voor toxocariasis. Bovendien werd T. canis vaker gedetecteerd bij puppy's jonger dan 6 maanden; terwijl Ancylostoma spp. meer werd gediagnosticeerd bij volwassen honden. Interessant is dat er geen verschil werd gevonden tussen hondenrassen. De hondenhaakworm besmette 65.54% van de buitenhonden; toch werd T. canis evenzeer gedetecteerd bij honden met een buiten- of binnenstatus.
Figuur 1: Afname van ontlastingsmonsters bij honden. (A) Voorzichtigheid is geboden bij het nemen van ontlastingsmonsters van wilde honden. Indien mogelijk moeten verse uitwerpselen worden verzameld en in een plastic zak worden bewaard voor indiening en coproparasitoscopische analyse in het laboratorium. De monsters moeten worden gekoeld bij 4 °C en binnen 24 uur na afname in piepschuimdozen of geïsoleerde metalen enveloppen worden gedaan. (B) Drie gram uitwerpselen wordt aanbevolen als standaard; Daarom is 2-5 g redelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bereiding van een verzadigde zoutoplossing en verwerking van de fecale suspensie voor microscopie. (A) De ideale dichtheid van een verzadigde oplossing gemaakt met zout moet meer dan 1,20 zijn. Het wordt ten zeerste aanbevolen om te controleren of er geen kristallen op de bodem zitten en of de oplossing transparant is. (B) Door de fecale suspensie door een plastic zeef te halen, worden grove deeltjes verwijderd. (C) De entlus moet worden blootgesteld aan een vlam (een laboratoriumbrander of een gewone draagbare aansteker) om ervoor te zorgen dat deze vrij is van verontreiniging. (D) Laat de entlus afkoelen en neem drie druppels op verschillende plaatsen op het oppervlak van de suspensie. (E) Nadat u de eerste druppel op het glasplaatje hebt geplaatst, moet u het glaasje niet verplaatsen om het morsen van de druppel te verminderen. De glazen objectglaasje biedt een dun en transparant platform dat de waarneming van monsters mogelijk maakt. (F) Plaats de tweede druppel in het midden van het glasplaatje. Het nemen van een tweede druppel van het oppervlak van de fecale suspensie verhoogt de kans op het vinden van eieren in een suspensie waar parasitaire structuren mogelijk ongelijk verdeeld zijn. (G) Plaats de derde druppel op het glasplaatje. Een derde druppel van het oppervlak van de fecale suspensie maakt het mogelijk om een ander gebied te observeren waar drijvende eieren zich mogelijk hebben geconcentreerd. (H) De drie druppels worden afzonderlijk op het objectglaasje waargenomen om nematodeneitjes uit verschillende delen van het oppervlak van de fecale suspensie te detecteren. (I) Observeer het monster onder een microscoop met behulp van het 10x-objectief. Als het objectief wordt gewijzigd in 40x, plaats dan een afdekglaasje op de fecale suspensiedruppels. Wanneer een positief resultaat wordt waargenomen in de druppel, wijst u een kruis (+) toe om de aanwezigheid van parasieten in de octrooiperiode op willekeurige plaatsen van het fecale suspensieoppervlak te markeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Eieren van Toxocara canis en Ancylostoma spp. gedetecteerd door lichtmicroscopie met een vergroting van 40x. (A) Eieren van Toxocara canis gedetecteerd door lichtmicroscopie met behulp van 40x vergroting. De flotatiemethode maakte het mogelijk om schone microscopisch kleine velden te visualiseren die vrij waren van grove materialen (verzameld in een veldomgeving). Ongeacht de bereidingswijze van de flotatieoplossing waren de eieren zichtbaar en werden ze voornamelijk waargenomen zonder morfologische veranderingen. (B) Eieren van Ancylostoma spp. gedetecteerd door lichtmicroscopie met een vergroting van 40x. Hoewel er geen concentratie van uitwerpselen werd uitgevoerd (in een veldomgeving), heeft de eenvoudige flotatiemethode de tekortkomingen van de morfologische detectie van eieren in uitwerpselen aangepakt wanneer de procedure volgens de huidige methode werd uitgevoerd. (C) Eieren van T. canis en Ancylostoma spp. gedetecteerd door lichtmicroscopie met een vergroting van 40x. Morfologische kenmerken van deze eieren (teruggevonden in een laboratoriumomgeving) waren duidelijk, hoewel er geen concentratie van ontlastingsmonsters werd gedaan en niet verschilde van de eieren die in een veldomgeving werden teruggevonden. Schaalbalken = 75 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Ancylostoma spp. | Canis van Toxocara | ||
| Klimaat | Warm klimaat | 38,66A | 22,52EEN |
| Droog klimaat | 29.41A | 36.03EEN | |
| Gematigd klimaat | 31,93een | 41,44ter | |
| Lente | 23,76een | 19.81EEN | |
| Zomer | 49,81b | 50,00b | |
| Herfst | 17.52EEN | 20.27EEN | |
| Winter | 8,88c | 9,90c | |
| Geslacht | Mannelijk | 60,86een | 62,61een |
| Vrouwelijk | 39.13ter | 37,38ter | |
| Leeftijd | 0-3 maanden | 18.72EEN | 51,80A |
| 3-6 maanden | 15.48EEN | 32.43b | |
| > 6 maanden | 22.44EEN | 10.36c | |
| > 1 jaar | 43.33ter | 5.40c | |
| Ras | Gekruist | 52,78A | 55,86A |
| Volbloed | 47.22A | 44.14a | |
| Status van de huisvesting | Indoor | 34,45A | 52,25A |
| Openlucht | 65,54A | 47,74b |
Tabel 2: Prevalentie (%) van Ancylostoma spp. en Toxocara canis bij honden in Mexico gedurende 4 jaar volgens klimaat, seizoen, geslacht, leeftijd, ras en huisvestingsstatus. Indicaties uit de gegevens laten zien dat er geen significante variatie is in de prevalentie van Ancylostoma spp. in gebieden die worden gekenmerkt door warme, gematigde of droge klimaten. Daarentegen vertoont T. canis een opmerkelijk hogere prevalentie in gematigde en droge klimaten in vergelijking met warme klimaten. Bovendien worden zowel Ancylostoma spp. als T. canis het vaakst geïdentificeerd tijdens het zomerseizoen. Analyse van de gegevens toont verder aan dat 60.86% van de reuen positief testte op ancylostomiasis, terwijl 37.38% positief testte op toxocariasis. Bovendien wordt T. canis vaker gedetecteerd bij puppy's jonger dan 6 maanden, terwijl Ancylostoma spp. vaker voorkomt bij volwassen honden. Interessant is dat er geen waarneembare verschillen werden waargenomen tussen verschillende hondenrassen. De bevindingen geven aan dat 65.54% van de buitenhonden besmet is met hondenhaakworm, terwijl T. canis komt even vaak voor bij binnen- als buitenhonden. *Gemiddelde waarden binnen een kolom van de factor (Klimaat, Seizoen, Geslacht, Leeftijd, Ras en Huisvesting) gevolgd door dezelfde letters zijn niet significant verschillend bij P < 0,05 volgens de ANOVA-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nematoden zoals T. canis en Ancylostoma spp. kunnen in de dunne darm van honden leven en kunnen op mensen worden overgedragen. Klinische symptomen veroorzaakt door T. canis zijn ernstig bij jonge honden en manifesteren zich als slechte groei, ademhalingsproblemen of laesies van het spijsverteringskanaal28. Bij volwassen honden is de infectie meestal mild. De diagnose is gebaseerd op het identificeren van karakteristieke eieren in een fecaal monster. Deze aandoening is een veel voorkomende oorzaak voor het voorschrijven van anthelmintische behandeling aan honden29. Om de epidemiologie van Toxocara te begrijpen, is het essentieel om te erkennen dat de parasiet van de moeder op de puppy kan worden overgedragen, zowel via de placenta vóór de geboorte als door te zogen als een galactogene infectie kort na het werpen. Mensen kunnen T. canis oplopen bij het inslikken van infectieuze eieren, die op verschillende manieren kunnen gebeuren, zoals besmette grond of de vacht van een geïnfecteerde hond. In dit geval dienen mensen als paratenische gastheren, en hoewel er geen parasitaire voortplanting is, kunnen de vrijgekomen larven uit de eieren mogelijk schade aanrichten, vooral in het geval van kinderen30.
Infectie met de haakworm Ancylostoma spp. bij honden treedt op wanneer de dieren de larven inslikken of wanneer larven de huid binnendringen. Puppy's kunnen de infectie oplopen door een paratenische gastheer te consumeren of via de lactogene route31. Volwassen haakwormen voeden zich met bloed, wat mogelijk kan leiden tot ernstige bloedarmoede en gastro-intestinale symptomen, vooral bij jonge honden. Infecties die via de huid optreden, resulteren in dermatitis, die meestal ongeveer een week na het begin van de infectie verdwijnt. Er zijn verschillende anthelmintica gebruikt, vergezeld van ondersteunende therapie. Er zijn echter meldingen geweest van resistentie tegen anthelmintica. Ancylostoma kan pathogeen zijn voor de mens. De transcutane overdracht van L3-larven kan leiden tot een aandoening die bekend staat als cutane larve migrans. Deze laesies verdwijnen over het algemeen zonder behandeling gedurende een paar maanden. In zeldzame gevallen kunnen de haakwormen bij honden migreren naar het menselijke maagdarmkanaal, waardoor eosinofiele enteritis wordtgeïnduceerd30.
De nauwkeurige, economische en snelle diagnose van parasitose bij honden is essentieel om onze epidemiologische kennis van hondenhelminthiases te vergroten. Om deze reden hebben we een protocol van de eenvoudige flotatietechniek aangepast om in een veldomgeving te worden gebruikt om T. canis en Ancylostoma spp. te detecteren. Een relevant probleem in het huidige protocol was het verzamelen van monsters van wilde honden, omdat deze dieren meestal moeilijk te hanteren zijn. Daarom werd de bemonstering gedaan door de honden te observeren en te volgen totdat ze poepen, waardoor de bemonsteringsmethode tijdrovend, uitdagend en op de een of andere manier gevaarlijk was. Op basis van onze ervaring raden we ten zeerste aan om parasitologische studies bij asielhonden te beoordelen.
Wat het herstel van zoönotische wormeieren betreft, blijft kwalitatieve coproscopie de methodologie die gewoonlijk wordt gebruikt in het parasitologisch laboratorium voor diagnostische doeleinden1. Eerdere studies hebben aangetoond dat de flotatietechniek met behulp van een verzadigde zoutoplossing betrouwbaarder is dan directe microscopie. Dryden en medewerkers bepaalden bijvoorbeeld een gevoeligheid van 95,15% voor Ancylostoma spp. eieren in 206 fecale monsters verwerkt door de flotatietechniek en 27,18% door directe microscopie32. Aangenomen wordt dat de dichtheid van de flotatieoplossing een kritische factor is voor de flotatiemethode 14,20,23. In oplossingen die die dichtheid niet bereiken, doen de parasitaire vormen er langer over om te drijven of nooit te drijven. Wanneer een flotatieoplossing oververzadigd is, kristalliseert deze binnen een paar minuten en zelfs eerder als er een dekglaasje wordt geplaatst20.
De keuze voor de flotatieoplossing in dit protocol was gebaseerd op het gemak van de voorbereiding, het gemak, de kosten en de impact op het milieu. Hoewel de suikeroplossing er langer over doet om te kristalliseren, moet formaline of fenol als conserveermiddel worden toegevoegd en het plakkerige of kleverige gevoel verminderen; wat een ongemak is onder de veldomstandigheden die in dit onderzoek heersten. Bovendien is de verwijdering van chemische reagentia een complexe kwestie vanwege milieuvoorschriften. Gegevens in deze studie toonden aan dat de verzadigde oplossing bereid met gewoon keukenzout onder veldomstandigheden met behulp van een frisdrankfles vanwege het gebrek aan beschikbaarheid van laboratoriumapparatuur om een flotatieoplossing te bereiden en te koken, even effectief was als de oplossing die in een laboratoriumomgeving werd bereid. Het enige waarneembare verschil is de langere tijd die nodig is om de frisdrankfles te schudden totdat er een transparante oplossing te zien is. Microscopische waarnemingen waren even schoon voor het monster dat met beide methoden was bereid om de verzadigde oplossing te bereiden. Het is belangrijk om in de toekomst meer studies uit te voeren met een groter aantal monsters om de bovengenoemde stelling te bevestigen. Toch is het tijdrovend en vereist het de fysieke inspanning om de oplossing urenlang in de fles te schudden. Een andere cruciale stap van het protocol bestaat erin de fecale suspensie ten minste 15 minuten te laten staan om de eieren te laten drijven en zich op het oppervlak te concentreren. Hoe langer de rusttijd, hoe meer vuil er zal drijven en na een paar uur zullen de eieren vervormen of breken. Gezien het feit dat de gevoeligheid en specificiteit van coproparasitoscopische methoden laag zijn en dat de nauwkeurigheid van deze methoden als diagnostische tests afhangt van de vaardigheden van de gebruiker, hebben in de huidige studie getrainde en ervaren parasitologen de flotatietechniek uitgevoerd en de parasieten geïdentificeerd.
Deze studie is, voor zover wij weten, de eerste die de prevalentie van Ancylostoma spp. en T. canis bij honden in Mexico schat met behulp van fecale monsters die zijn onderzocht met de eenvoudige flotatiemethode in een veldomgeving. Hierin werd aangetoond dat de flotatietechniek die we gebruikten, ondanks de decennia die we hebben gebruikt, nog steeds een zeer effectieve, economische en snelle diagnostische test is14. Toch zijn er coproparasitoscopische technieken met een hogere gevoeligheid en specificiteit dan degene die we hebben gebruikt voor de diagnose van hondenwormen; zoals de sedimentatieconcentratie, zoals het geval is bij de Faust-techniek. Verder is het belangrijk op te merken dat Faust, een concentratiemethode, ook effectiever is gebleken bij de detectie van protozoa zoals Giardia33. Desalniettemin had de coproparasitoscopische methode die we voor deze studie kozen verschillende voordelen, zoals de kosten. De Faust-techniek is duurder dan flotatie met een met zout verzadigde oplossing omdat er extra en dure apparatuur voor nodig is, zoals een centrifuge. Andere concentratiemethoden, zoals die met reagentia zoals zinksulfaat, zijn duurder dan keukenzout en hebben meer tijd nodig vanwege het aantal vereiste wasbeurten in de centrifuge. Daarom is de Faust-techniek beperkt voor gebruik in veldwerk waar geen toegang tot een centrifuge gebruikelijk is.
Het belangrijkste is dat een beperking van de eenvoudige flotatietechniek is dat deze niet gevoelig genoeg is om Cryptosporidium-oöcysten, Giardia-cysten of Trichuris-eieren te detecteren. Technieken waarbij gebruik wordt gemaakt van centrifugatieprocédés om parasietvormen te concentreren, moeten daarom worden gebruikt als de diagnose van deze soorten wordt voorgenomen. Het is belangrijk om te benadrukken dat de positiviteitspercentages van de geslachten die in deze studie zijn gerapporteerd, niet als overtuigend moeten worden beschouwd omdat een gemaksmethode als bemonsteringsstrategie werd gebruikt. Het is belangrijk op te merken dat er situaties kunnen zijn, zoals in opvangcentra met uitdagend dierenbeheer, waarin het cruciaal wordt om wormparasieten bij honden te identificeren. Als gevolg hiervan kan het zijn dat dit protocol in de toekomst moet worden aangepast om het verzamelen van gecombineerde monsters mogelijk te maken.
Als zwak punt moet worden opgemerkt dat de eenvoudige flotatiemethode en de bereiding van de verzadigde oplossing van NaCl zijn ontwikkeld voor een specifiek doel - om hondenuitwerpselen te onderzoeken onder voornamelijk veldomstandigheden - maar de gevoeligheid van de eenvoudige flotatieprocedure wordt over het algemeen als laag beschouwd. Om cysten of eieren van zwaardere parasietsoorten te detecteren, wordt daarom sterk aangeraden om een concentratietechniek te gebruiken. Gezien de lage gevoeligheid van de eenvoudige flotatiemethode, ongeacht of deze in een veld- of laboratoriumomgeving wordt uitgevoerd, was het redelijk om te betwijfelen of deze techniek nuttig zou zijn als voorkeursmethode voor epidemiologische studies van wormparasieten bij honden. Desalniettemin geven de hoge prevalentie van Ancylostoma spp. bij honden in deze studie en de detectie van T. canis-eieren aan dat de eenvoudige flotatiemethode, of deze nu in een veld- of laboratoriumomgeving wordt uitgevoerd, nuttig is om bewijs te leveren dat verdere epidemiologische studies zou kunnen ondersteunen en controle- en preventieve maatregelen voor te stellen om de infectie van honden en mensen met deze nematoden te verminderen.
Met behulp van de eenvoudige flotatiemethode analyseerden we de factoren die van invloed zijn op het herstel van T. canis en Ancylostoma spp. eieren uit hondenuitwerpselen. De bevindingen van T. canis waren in overeenstemming met het laatste onderzoek dat aangeeft dat parasieten met name vaker voorkomen in gematigde en tropische streken. Dit komt overeen met eerdere studies die hebben onderzocht hoe omgevingsfactoren, met name temperatuur en regenval, het ecologische bereik van parasietsoorten beïnvloeden 34,35,36. De huidige resultaten toonden aan dat beide wormen mannetjes in een significant hoger aandeel infecteren. Het is redelijk om te speculeren dat deze bevinding kwam omdat mannen immunologisch minder reageren op infecties 37,38. Leeftijd beïnvloedt de prevalentie van T. canis, aangezien puppy's meer last hadden van deze parasiet. Deze bevinding komt overeen met eerder onderzoek dat aangeeft dat deze parasiet de neiging heeft om puppy's in grotere mate te beïnvloeden, terwijl volwassenen een verhoogde weerstand ontwikkelen, wat resulteert in een lagere kans op infectie 6,39. Zowel gekruiste als rashonden vertoonden vergelijkbare prevalenties van Toxocara canis en Ancylostoma spp. Wilde honden vertoonden echter een hogere prevalentie van Ancylostoma spp. in vergelijking met honden die in huiselijke omgevingen woonden. Deze bevinding is in tegenspraak met eerdere rapporten die geen verschillen tussen hondenrassen ontdekten6. Er kan worden geconcludeerd dat toekomstige toepassingen van de bereiding van de verzadigde zoutoplossing en de eenvoudige flotatiemethode die in dit protocol wordt gebruikt, kunnen worden uitgevoerd voor routinematige fecale onderzoeken onder veld- of laboratoriumomstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs zijn de Dirección General de Asuntos del Personal Académico van de Universidad Nacional Autónoma de México dankbaar voor het verstrekken van de financiële middelen door middel van subsidie PAPIIT IN218720 en Dr. Claudia Mendoza voor het verlenen van de gevraagde verlenging. Dit werk is opgedragen aan mijn lieve Nicole, die in 2019 is overleden. Je zult altijd in mijn hart leven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
References
- Duncan, K. T., Koons, N. R., Litherland, M. A., Little, S. E., Nagamori, Y. Prevalence of intestinal parasites in fecal samples and estimation of parasite contamination from dog parks in central Oklahoma. Veterinary Parasitology Regional Studies and Reports. 19, 100362 (2020).
- Kisiel, L. M., et al. Owned dog ecology and demography in Villa de Tezontepec, Hidalgo, Mexico. Preventive Veterinary Medicine. 135, 37-46 (2016).
- Lyons, M. A., Malhotra, R., Thompson, C. W. Investigating the free-roaming dog population and gastrointestinal parasite diversity in Tulúm, México. PLoS One. 17 (10), e0276880 (2022).
- Dantas-Torres, F., et al. TROCCAP recommendations for the diagnosis, prevention and treatment of parasitic infections in dogs and cats in the tropics. Veterinary Parasitology. 283, (2020).
- Cantó, G. J., García, M. P., García, A., Guerrero, M. J., Mosqueda, J. The prevalence and abundance of helminth parasites in stray dogs from the city of Querétaro in central Mexico. Journal Of Helminthology. 85 (3), 263-269 (2011).
- Torres-Chablé, O. M., et al. Prevalence of gastrointestinal parasites in domestic dogs in Tabasco, Southeastern Mexico. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 24 (4), 432-437 (2015).
- Cortez-Aguirre, G. R., Jiménez-Coello, M., Gutiérrez-Blanco, E., Ortega-Pacheco, A. Stray dog population in a city of Southern Mexico and its impact on the contamination of public areas. Veterinary Medicine International. 2018, 1-6 (2018).
- Rodríguez-Vivas, R. I., et al. An epidemiological study of intestinal parasites of dogs from Yucatán, Mexico, and their risk to public health. Vector Borne Zoonotic Diseases. 11 (8), 1141-1144 (2011).
- Maggi, R. G., Krämer, F. A review on the occurrence of companion vector-borne diseases in pet animals in Latin America. Parasites & Vectors. 12 (1), 145 (2019).
- Cruz-Vazquez, C., Castro, G., Parada, F., Ramos, P. Seasonal occurrence of Ctenocephalides felis and Ctenocephalides canis (siphonaptera:Pulicidae) infesting dogs and cats in an urban area in Cuernavaca, Mexico. Entomological Society of America. 38 (1), 111-113 (2001).
- Bolio-Gonzalez, M. E., et al. Prevalence of the Dirofilaria immitis infection in dogs from Mérida, Yucatán, Mexico. Veterinary Parasitology. 148 (2), 166-169 (2007).
- Pastor-Santiago, J. A., Flisser, A., Chávez-López, S., Guzmán-Bracho, C., Olivo-Díaz, A. American visceral leishmaniasis in Chiapas, Mexico. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86 (1), 108-114 (2012).
- Trasviña-Muñoz, E., et al. Detection of intestinal parasites in stray dogs from a farming and cattle region of Northwestern Wexico. Pathogens. 9 (7), (2020).
- Ballweber, L. R., Beugnet, F., Marchiondo, A. A., Payne, P. A. American Association of Veterinary Parasitologists' review of veterinary fecal flotation methods and factors influencing their accuracy and use--is there really one best technique. Veterinary Parasitology. 204 (1-2), 73-80 (2014).
- Nielsen, M. K. What makes a good fecal egg count technique. Veterinary Parasitology. 296, 109509 (2021).
- Gordon, H. M., Whitlock, H. V. A new technique for counting nematode eggs in sheep faeces. Journal of the Council for Scientific and Industrial Research. 12 (1), 50-52 (1939).
- O'grady, M. R., Slocombe, J. O. D. An investigation of variables in a fecal flotation technique. Canadian Journal of Comparative Medicine. 44 (2), 148 (1980).
- ESCCAP. Worm control in dogs and cats. Guideline 01. European Scientific Counsel Companion Animal Parasites. , (2017).
- Cringoli, G., et al. Ancylostoma caninum: Calibration and comparison of diagnostic accuracy of flotation in tube, McMaster and FLOTAC in faecal samples of dogs. Experimental Parasitology. 128 (1), 32-37 (2011).
- Figueroa, C. J. A. Examen coproparasitoscópico. In: Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria, Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal. AMPAVE-CONASA. , 83-105 (2015).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Adolph, C., et al. Diagnostic strategies to reveal covert infections with intestinal helminths in dogs. Veterinary Parasitology. 247, 108-112 (2017).
- Cringoli, G., Rinaldi, L., Maurelli, M. P., Utzinger, J. FLOTAC: New multivalent techniques for qualitative and quantitative copromicroscopic diagnosis of parasites in animals and humans. Nature Protocols. 5 (3), 503-515 (2010).
- Katagiri, S., Oliveira-Sequeira, T. C. Comparison of three concentration methods for the recovery of canine intestinal parasites from stool samples. Experimental Parasitology. 126 (2), 214-216 (2010).
- Rehbein, S., Lindner, T., Visser, M., Winter, R. Evaluation of a double centrifugation technique for the detection of Anoplocephala eggs in horse faeces. Journal of Helminthology. 85 (4), 409-414 (2011).
- Liccioli, S., et al. Sensitivity of double centrifugation sugar fecal flotation for detecting intestinal helminths in coyotes (Canis latrans). Journal of Wildlife Diseases. 48 (3), 717-723 (2012).
- Rishniw, M., Liotta, J., Bellosa, M., Bowman, D., Simpson, K. W. Comparison of 4 Giardia diagnostic tests in diagnosis of naturally acquired canine chronic subclinical giardiasis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 24 (2), 293-297 (2010).
- Barutzki, D., Schaper, R. Endoparasites in dogs and cats in Germany 1999-2002. Parasitology Research. 90, S148-S150 (2003).
- Carlin, E. P., Tyungu, D. L. Toxocara: Protecting pets and improving the lives of people. Advances in Parasitology. 109, 3-16 (2020).
- Saari, S., NaReaho, A., Nikander, S. Canine parasites and parasitic diseases. , Academic Press. (2019).
- Bowman, D. D., Montgomery, S. P., Zajac, A. M., Eberhard, M. L., Kazacos, K. R. Hookworms of dogs and cats as agents of cutaneous larva migrans. Trends in Parasitology. 26 (4), 162-167 (2010).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Barutzki, D., Schaper, R. Results of parasitological examinations of faecal samples from cats and dogs in Germany between 2003 and 2010. Parasitology Research. 109, S45-S60 (2011).
- Novobilský, A., Novák, J., Björkman, C., Höglund, J. Impact of meteorological and environmental factors on the spatial distribution of Fasciola hepatica in beef cattle herds in Sweden. BMC Veterinary Research. 11, 128 (2015).
- Pickles, R. S., Thornton, D., Feldman, R., Marques, A., Murray, D. L. Predicting shifts in parasite distribution with climate change: A multitrophic level approach. Global Change Biology. 19 (9), 2645-2654 (2013).
- Pérez-Rodríguez, A., De La Hera, I., Fernández-González, S., Pérez-Tris, J. Global warming will reshuffle the areas of high prevalence and richness of three genera of avian blood parasites. Global Chaneg Biology. 20 (8), 2406-2416 (2014).
- Nava-Castro, K., Hernández-Bello, R., Muñiz-Hernández, S., Camacho-Arroyo, I., Morales-Montor, J. Sex steroids, immune system, and parasitic infections: Facts and hypotheses. Annals Of The New York Academy Of Sciences. 1262, 16-26 (2012).
- Morales-Montor, J., Escobedo, G., Vargas-Villavicencio, J. A., Larralde, C. The neuroimmunoendocrine network in the complex host-parasite relationship during murine cysticercosis. Current Topics in Medicinal Chemistry. 8 (5), 400-407 (2008).
- Olave-Leyva, J., et al. Prevalencia de helmintos gastrointestinales en perros procedentes del servicio de salud de Tulancingo, Hidalgo. Abanico Veterinario. 9 (1), 1-10 (2019).
