単細胞のカ エノハブディティス・エレガンスの解離 : 生細胞を分離する方法

Overview

このビデオでは、ワーム全体を単一細胞懸濁液に解き分ける方法を説明し、FACSまたは無傷細胞の免疫沈降に適した方法について説明します。

Protocol

このプロトコルはドイツからの抜粋であり、回虫カエノハブディティス・エレガンスからの特定のニューロン集団の単離、J.Vis. Exp. (2019)

1. 細胞分離のための老化したワームの準備と収集

注:以下に説明するのは、ミネソタ大学のカエノハブディティス遺伝学センター(CGC)株リポジトリから得られたトランスジェニックunc-17からのコリン作動性ニューロンの分離です。菌や細菌からの汚染を防ぐために、滅菌状態を維持することが不可欠です。

1. T. Stiernagle の説明に従って漂白方法を使用してワームを準備し、同期します。老化実験では、卵の生産を減らし卵孵化を阻止するために、フルオロデキシウリジン(FuDR)の25μM水溶液を含む線虫成長培地(NGM)プレートにプレートワーム。寒天プレートを定期的に点検して、汚染や卵の孵化を防ぎ、信頼性の低い結果を引き起こします。
   注:unc-17::GFP細胞の場合、通常、3つの100 mm x 15 mm NGMプレートが、十分な量の細胞を単離するために使用されます。
2. ワームを収集し、細胞分離のためのバッファを準備します。
   1. 15 mL円錐形チューブにワームを集める。M9バッファー(1.5 mM MgSO 4、85 mMNaCl、42 mM Na 2 HPO4·7H₂O、22 mM_KH2PO、pH 7.0)と遠心分離機を1,600 x gで5分間洗浄します。上清を捨て、M9バッファの1 mLでワームを洗浄します。遠心分離を繰り返し、合計5回洗浄して、できるだけ多くの大腸菌汚染を取り除きます。
      注: このステップで、アンピシリンなどの抗生物質(50 μg/mL)を添加することで、細菌汚染を減らすことができます。
   2. 2つのサンプルの場合、2 mLのドデシル硫酸ジチオトライトール(SDS-DTT)リシスバッファーを調製します:200 mM DTT、0.25%(w/v)SDS、20 mM HEPES(pH 8.0)、および3%(w/v)スクロース。
   3. 15 mLの分離バッファー(118 mM NaCl、48 mM KCl、2 mM CaCl_2、2mM MgCl_2、25mM HEPES [pH 7.3])を準備し、氷の上に保管します。
      注: SDS-DTT ライシス バッファーと分離バッファーは、各実験の前に新しくする必要があります。
3. キューティクルの破壊と単一細胞分離
   1. 遠心分離機動物はステップ1.2.1で収集し、1,600 x gで5分間収集した。M9培地の1 mLですべての上澄みと懸濁液のワームを取り除き、1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。
   2. 5分間1,600 x g で遠心分離を有するペレットワーム。
   3. 200 μL の SDS-DTT リシス バッファーをワームに加え、室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。ワームは、軽い顕微鏡で見れば、体に沿って「ウィンク」されているように見えるはずです。
      注: SDS-DTTリシスバッファーへの長期暴露は、ワームの死をもたらし、それは、ワームを観察することによって監視することができる。死んだワームは伸び、カールしません。
   4. 800 μLの氷冷分離バッファーを加え、チューブを軽くフリックして混ぜます。
   5. ペレットワームは4°Cで13,000 x g で1分間、上清を除去し、1 mLの分離バッファーで洗浄します。
   6. ステップ 1.3.5 を合計 5 回繰り返し、毎回分離バッファーを慎重に取り除きます。
   7. ストレプトマイセス・グリセウス(15mg/mL)(材料表)から100μLのプロテアーゼ混合物をペレットに分離バッファーに溶解し、RTで10〜15分間インキュベートします。
      注: SDS-DTTリシスバッファーと同様に、拡張プロテアーゼ消化は、形質膜に沿ってタンパク質の過剰な切断をもたらし、磁気ビーズを介して露出した表面GFPの単離を防止する可能性があります。
   8. プロテアーゼ混合物とのインキュベーション中に、200 μLマイクロピペットチップを用いた1.5 mLマイクロ遠心チューブの底部に対してサンプルを上下にピペットして、機械的破壊を60~70回塗布します。ピペットチップをマイクロ遠心分離管の壁に対して一定の圧力で保ち、細胞の適切な関連付けを解除します。
   9. 消化の段階を決定するには、消化混合物の少量(〜1〜5 μL)を取り除き、ガラススライドに落とし、組織培養顕微鏡を使用して検査します。5-7分のインキュベーションの後、ワーム断片は目に見えてキューティクルを減少させ、細胞のスラリーが容易に見えるはずです。
   10. 10%のウシ胎児血清(FBS)とペニシリンストレプトマイシン(50 U/mLペニシリンおよび50 μg/mLストレプトマイシンでの最終濃度)を添加した、市販の冷たいライボヴィッツのL-15培地の900 μLで反応を停止する。
   11. ペレットは、4°Cで10,000 x g で5分間遠心分離することにより断片および細胞を単離した。 ペレット化した細胞を1 mLの冷たいL-15補充培地でさらに2回洗い、余分な破片やキューティクルを確実に取り除きます。
   12. ペレット化された細胞をL-15補充培地の1 mLで再懸濁し、氷の上に30分間放置します。最上層(約700~800μL)をマイクロ遠心チューブに取り付けます。この層は細胞デブリのない細胞を含み、その後の目的の細胞の分離に使用されます。
   13. メーカーの指示に従って、自動セルカウンターまたはヘモサイトメーターを使用して、10~25μLの単離セルの細胞密度を測定します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010