Caenorhabditis elegans'ınTek Hücreli Ayrışması : Canlı Hücreleri İzole Etme Yöntemi

Overview

Bu videoda, tüm solucanları FACS veya bozulmamış hücrelerin immün önseçimlerine uygun tek hücreli bir süspansiyona ayırma yöntemi açıklanmaktadır.

Protocol

Bu protokol, Almanya ve ark. Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019)'dan Spesifik Nöron Popülasyonlarının İzolasyonu'ndan bir alıntıdır.

1. Hücre izolasyonu için yaşlı solucanların hazırlanması ve toplanması

NOT: Minnesota Üniversitesi'ndeki Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) suş deposundan elde edilen transgenik unc-17::GFPsuşundan (OH13083) kolinerjik nöronların izolasyonu aşağıda açıklanmıştır. Mantarlardan veya bakterilerden bulaşmayı önlemek için steril koşulları korumak zorunludur.

1. Solucanları T. Stiernagle tarafından açıklandığı gibi ağartma yöntemiyle hazırlayın ve senkronize edin. Yaşlanma deneyleri için, yumurta üretimini azaltmak ve yumurta taramasını tutuklamak için 25 μM florodeoksiyuridin (FuDR) su çözeltisi içeren nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarına solucanlar. Güvenilir olmayan sonuçlara neden olacağından kirlenmeyi veya yumurtadan çıkmayı önlemek için agar plakalarını düzenli olarak inceleyin.
   NOT: UNC-17::GFP hücreleri için, yeterli miktarda ilgi çekici hücreyi izole etmek için tipik olarak üç adet 100 mm x 15 mm NGM plakası kullanılır.
2. Solucanları toplayın ve hücre yalıtımı için arabellekler hazırlayın.
   1. Solucanları 15 mL konik tüpte toplayın. Solucanları 1,5 mL M9 tampon (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na 2 HPO4·7H₂O,₂₂mM KH₂PO, pH 7,0) ve santrifüj ile 1,600 x g'da 5 dakika boyunca plakadan yıkayın. Süpernatant atın ve solucanları 1 mL M9 tamponu ile yıkayın. Santrifüjü tekrarlayın ve mümkün olduğunca fazla E. coli kontaminasyonunu gidermek için toplam beş kez yıkayın.
      NOT: Bu adımda ampisilin gibi antibiyotikler (50 μg/mL) eklemek bakteriyel kontaminasyonu azaltmaya yardımcı olabilir.
   2. İki örnek için 2 mL sodyum dodecyl sülfat-dithiothreitol (SDS-DTT) lizoz tamponu hazırlayın: 200 mM DTT, %0,25 (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8.0) ve %3 (w/v) sakkaroz.
   3. 15 mL izolasyon tamponu hazırlayın (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) ve buz üzerinde saklayın.
      NOT: Her denemeden önce hem SDS-DTT liziz arabelleği hem de yalıtım arabelleği yenilenmelidir.
3. Manikül bozulması ve tek hücre izolasyonu
   1. Santrifüj hayvanları 1.2.1 adımında 1.600 x g'da5 dakika boyunca toplandı. Tüm süpernatantı çıkarın ve solucanları 1 mL M9 ortama askıya alın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   2. 5 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüjlemeli pelet solucanları.
   3. Solucanlara 200 μL SDS-DTT liziz tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın. Solucanlar, hafif bir mikroskop altında görüntülenirse vücut boyunca "göz kırpılmış" görünmelidir.
      NOT: SDS-DTT lizis tamponunun uzun süre maruz kalması, solucanların gözlemlenmesiyle izlenebilen solucanların ölümüne neden olabilir. Ölü solucanlar uzayacak ve kıvrılmayacak.
   4. 800 μL buz gibi izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü hafifçe sallayarak karıştırın.
   5. 4 °C'de 13.000 x g'da 1 dakika boyunca pelet solucanları, süpernatant çıkarın ve 1 mL izolasyon tamponu ile yıkayın.
   6. 1.3.5. adımı toplam beş kez yineleyin ve yalıtım arabelleği her seferinde dikkatlice çıkarın.
   7. İzolasyon tamponunda çözünmüş Streptomyces griseus'tan (15 mg/mL)100 μL proteaz karışımını pelete ekleyin ve RT'de 10−15 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: SDS-DTT lizis tamponunda olduğu gibi, genişletilmiş proteaz sindirimi plazma zarı boyunca proteinlerin aşırı bölünmesine neden olabilir ve yüzeye maruz kalan GFP'nin manyetik boncuklar yoluyla izolasyonunu önleyebilir.
   8. Proteaz karışımı ile inkübasyon sırasında, numuneleri ~60−70 kez 200 μL mikropiplet ucu ile 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün dibine kadar yukarı ve aşağı pipetleme ile mekanik bozulma uygulayın. Pipet ucunu mikrosantrifüj tüpünün duvarına doğru şekilde ayırmak için sabit basınçla tutun.
   9. Sindirim aşamasını belirlemek için, sindirim karışımının küçük bir hacmini (~1−5 μL) çıkarın, cam bir kaydırağa bırakın ve bir doku kültürü mikroskobu kullanarak inceleyin. 5−7 dakikalık inkübasyondan sonra, solucan parçaları gözle görülür şekilde azaltılmış maniküre sahip olmalıdır ve bir hücre bulamacı kolayca görülebilir.
   10. %10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin (50 U/mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin'de son konsantrasyon) ile desteklenmiş 900 μL'lik soğuk Leibovitz'in L-15 ortamı ile reaksiyonu durdurun.
   11. Pelet, parçaları ve hücreleri 4 °C'de 10.000 x g'da 5 dakika santrifüjleme ile izole etti. Fazla döküntü ve manikür çıkarıldığından emin olmak için peletlenmiş hücreleri 1 mL soğuk L-15 takviyeli ortamla iki kez daha yıkayın.
   12. 1 mL L-15 takviyeli ortamda peletlenmiş hücreleri yeniden biriktirin ve 30 dakika boyunca buzda bırakın. Üst tabakayı, yaklaşık 700−800 μL'yi bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Bu katman hücre artıkları olmayan hücreler içerir ve daha sonra ilgi çekici hücrelerin izolasyonunda kullanılacaktır.
   13. Üreticinin talimatlarına uyarak, izole edilmiş hücrelerin 10−25 μL hücre yoğunluğunu ölçmek için otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010