Einzelzelldissoziation von Caenorhabditis elegans: Eine Methode, um lebende Zellen zu isolieren

Overview

Dieses Video beschreibt eine Methode, um ganze Würmer in eine einzellige Suspension zu dissoziieren, die für FACS oder Immunpräzipitation intakter Zellen geeignet ist.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Germany et al, Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Vorbereitung und Sammlung von gealterten Würmern zur Zellisolierung

HINWEIS: Im Folgenden wird die Isolierung von cholinergen Neuronen aus dem transgenen Unc-17::GFP-Stamm (OH13083) aus dem Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Stamm-Repository an der University of Minnesota erklärt. Es ist zwingend notwendig, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, um eine Kontamination durch Pilze oder Bakterien zu verhindern.

1. Vorbereiten und Synchronisieren von Würmern über die Bleichmethode, wie von T. Stiernagle beschrieben. Für Alterungsexperimente, Plattenwürmer auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) Platten mit 25 M Wasserlösung von Fluorodeoxyuridin (FuDR) zur Verringerung der Eiproduktion und Abstecken von Eischraffur. Überprüfen Sie agar platten regelmäßig, um Kontamination oder Eibrühe zu verhindern, da dies zu unzuverlässigen Ergebnissen führt.
   HINWEIS: Für unc-17::GFP-Zellen werden typischerweise drei 100 mm x 15 mm NGM-Platten verwendet, um eine ausreichende Menge von Komponenten von Interesse zu isolieren.
2. Sammeln Sie Würmer und bereiten Sie Puffer für die Zellisolierung vor.
   1. Sammeln Sie Würmer in einem 15 ml konischen Rohr. Waschwürmer von Platte mit 1,5 ml M9 Puffer (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO4-7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7,0) und Zentrifuge für 5 min bei 1.600 x g. Überstand entsorgen und Würmer mit 1 ml M9-Puffer waschen. Zentrifugation wiederholen und insgesamt fünfmal waschen, um so viel E. coli-Kontamination wie möglich zu entfernen.
      HINWEIS: Die Zugabe von Antibiotika (50 g/ml), wie Z. B. Ampicillin, kann in diesem Schritt dazu beitragen, die bakterielle Kontamination zu reduzieren.
   2. Für zwei Proben 2 ml Natriumdodecylsulfat-Dithiothreitol (SDS-DTT) Lysepuffer vorbereiten: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) und 3% (w/v) Saccharose.
   3. 15 ml Isolationspuffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) vorbereiten und auf Eis lagern.
      HINWEIS: Sowohl der SDS-DTT-Lysepuffer als auch der Isolationspuffer müssen vor jedem Experiment neu gemacht werden.
3. Cuticle Disruption und Single-Cell-Isolation
   1. Zentrifugentiere, die in Schritt 1.2.1 für 5 min bei 1.600 x ggesammelt wurden. Entfernen Sie alle Überstand und hängen Würmer in 1 ml M9-Medien und übertragen Sie in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
   2. Pelletwürmer mit Zentrifugation bei 1.600 x g für 5 min.
   3. Fügen Sie den Würmern 200 L SDS-DTT-Lysepuffer hinzu und brüten Sie 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Würmer sollten am Körper "gezwwinket" erscheinen, wenn sie unter einem Lichtmikroskop betrachtet werden.
      HINWEIS: Eine längere Exposition gegenüber dem SDS-DTT-Lysepuffer kann zum Tod von Würmern führen, die durch beobachtende Würmer überwacht werden können. Würmer, die tot sind, werden sich verlängeren und nicht krümmen.
   4. Fügen Sie 800 L eiskalten Isolationspuffer hinzu und mischen Sie, indem Sie das Rohr sanft flicken.
   5. Pelletwürmer für 1 min bei 13.000 x g bei 4 °C, Überstand entfernen und mit 1 ml Isolationspuffer waschen.
   6. Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 insgesamt fünfmal, wobei Sie jedes Mal den Isolationspuffer sorgfältig entfernen.
   7. 100 L Protease-Mischung aus Streptomyces griseus (15 mg/ml) (Materialtabelle)im Isolationspuffer gelöst in das Pellet geben und bei RT für 10 bis 15 min inkubieren.
      HINWEIS: Wie beim SDS-DTT-Lysepuffer kann die erweiterte Proteaseverdauung zu einer übermäßigen Spaltung der Proteine entlang der Plasmamembran führen und eine Isolierung der exponierten GFP-Oberfläche über magnetische Perlen verhindern.
   8. Während der Inkubation mit Protease-Gemisch, mechanische Störungen durch Pipettieren von Proben nach oben und unten gegen den Boden des 1,5 ml Mikrozentrifugenrohrs mit einer 200-L-Mikropipette-Spitze für 60-70-mal. Halten Sie die Pipettenspitze an der Wand des Mikrozentrifugenrohrs mit konstantem Druck, um Zellen richtig zu trennen.
   9. Um das Stadium der Verdauung zu bestimmen, entfernen Sie ein kleines Volumen (ca. 1,5 l) des Verdauungsgemisches, lassen Sie es auf einem Glasschlitten fallen und inspizieren Sie es mit einem Gewebekulturmikroskop. Nach 5-7 min Inkubation sollten Wurmfragmente sichtbar reduzierte Nagelhaut haben und eine Gülle von Zellen gut sichtbar sein.
   10. Haltereaktion mit 900 l handelsüblichen kalten Leibovitz-Mediums L-15, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration bei 50 U/ml Penicillin und 50 g/ml Streptomycin).
   11. Pellet isolierte Fragmente und Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 10.000 x g bei 4 °C. Waschen Sie die pelletierten Zellen mit 1 ml kalten L-15-ergänzten Medien zweimal mehr, um sicherzustellen, dass überschüssiger Schmutz und Nagelhaut entfernt werden.
   12. Pelletzellen in 1 ml L-15-ergänzungen Medien wieder aufsetzen und 30 min auf Demeis lassen. Nehmen Sie die oberste Schicht, ca. 700 x 800 L, in ein Mikrozentrifugenrohr. Diese Schicht enthält Zellen ohne Zellabfall und wird bei der anschließenden Isolierung von Interessenszellen verwendet.
   13. Verwenden Sie nach den Anweisungen des Herstellers einen automatisierten Zellzähler oder ein Hämozytometer, um die Zelldichte von isolierten Zellen von 10 bis 25 L zu messen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010