Summary
אנו מתארים מתודולוגיות חדשניות ופשוטות של סינתזה ואפיון של חלקיקי ליגנין מיקרו ותת-מיקרון תואמים ביולוגית. ניסוחים אלה מספקים גישה קלה לשימוש בהטרופולימר, כמו גם חלופה לתכנון רציונלי של מטריצות נשא רב תכליתיות עם ישימות פוטנציאלית בביו-רפואה, טכנולוגיה פרמצבטית ותעשיית המזון.
Abstract
הישימות של מיקרו-/ ננו-טכנולוגיה ביופולימרית ברפואה אנושית, וטרינרית, פרמצבטית וטכנולוגיית מזון גדלה במהירות בשל הפוטנציאל הגדול של חלקיקים מבוססי ביופולימרים כמערכות נשא יעילות. השימוש בליגנין כביומטריצה הטרופולימרית בסיסית לתכנון פורמולציות מיקרו/תת-מיקרון חדשניות מאפשר השגת תאימות ביולוגית מוגברת ומציע לקבוצות פונקציונליות פעילות שונות המציגות הזדמנויות להתאמה אישית של התכונות הפיזיקוכימיות והביו-פעילויות של הפורמולציות ליישומים מגוונים. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח מתודולוגיה פשוטה וידידותית לסביבה לסינתזה של חלקיקי ליגנין בגודל מיקרו ותת-מיקרון; להעריך את המאפיינים הפיזיקוכימיים, הספקטרליים והמבניים שלהם; ולבחון את יכולתם לאנקפסולציה של מולקולות פעילות ביולוגית ואת הפוטנציאל לשחרור חוץ גופי של ביופלבנואידים במדיה מדומה של מערכת העיכול. המתודולוגיות המוצגות מיישמות ממיסים זולים וירוקים; תהליכים קלים, פשוטים, מהירים ורגישים הדורשים מעט ציוד, חומרים לא רעילים ושיטות פשוטות לאפיונם, קביעת יכולת האנקפסולציה כלפי התרכובות הביו-אקטיביות המסיסות במים מורין וקוורצטין, ופוטנציאל השחרור במבחנה של מטריצות הליגנין.
Introduction
כיום הנטייה לביופולימרים כגון תאית, צ'יטוזן, קולגן, דקסטרן, ג'לטין וליגנין כמבשרי תכנון של נשאי מיקרו/תת-מיקרון בעלי גודל, תכונות פיסיקוכימיות ופונקציות ביולוגיות הניתנים להתאמה אישית גדלה בתעשיות הביו-רפואיות, התרופות וטכנולוגיית המזון בשל יישומם בהנדסת רקמות, הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, במבחנה פלטפורמות מידול מחלות, תעשיית אריזות, הכנת תחליב ואספקת חומרים מזינים בין היתר 1,2,3.
מחקרים חדשניים מדגישים את ההיבטים של הידרוג'לים מבוססי ליגנין, כמו גם מיקרו וננו-פורמולציות4 ככלי יתרון המשמשים לחומרי אריזה למזון5, אחסון אנרגיה6, קוסמטיקה7, מייצבי חום/אור, חומרים מחוזקים ומטריצות נושאות תרופות8 להעברת מולקולות הידרופוביות, שיפור מחסומי UV9כחומרים מחזקים בננו-מרוכבים, וכחלופה לננו-חלקיקים אנאורגניים עקב כמה בעיות בטיחות אחרונות 10,11,12., הסיבה מאחורי נטייה זו היא התאימות הביולוגית, יכולת ההתכלות הביולוגית ואי-הרעילות של הביופולימר ההטרו הטבעי, כמו גם הפעילות הביולוגית המוכחת שלו של פוטנציאל נוגד חמצון ליגנין ופעילות רדיקלית, אנטי-שגשוגית ואנטי-מיקרוביאלית 13,14,15,16,17.
הספרות המדעית מדווחת על שיטות שונות לסינתזה (הרכבה עצמית, משקעים נגד ממסים, משקעים חומציים והסטת ממסים)18 ואפיון של פורמולציות מיקרו/ננו-בקנה מידה מבוססות ליגנין, כולל יישום של ממסים יקרים או מזיקים כגון טטרהידרופורן (THF), דימתיל סולפוקסיד (DMSO), N,N-דימתילפורממיד (DMF) ואצטון, ותהליכים מסובכים, עקיפים ומייגעים המשתמשים בציוד רב ובחומרים רעילים 12,19,20.
כדי להתגבר על החסרונות האחרונים, הפרוטוקולים הבאים מציגים מתודולוגיות חדשניות לסינתזה של חלקיקי מיקרו/תת-מיקרון מבוססי ליגנין באמצעות ממיסים זולים וירוקים; תהליכים קלים, פשוטים, מהירים ורגישים הדורשים מעט ציוד, חומרים לא רעילים ושיטות פשוטות לאפיונם ולקביעת יכולת האנקפסולציה של תרכובות ביו-אקטיביות המסיסות במים ופוטנציאל שחרור במבחנה של מטריצות הליגנין. שיטות הייצור המוצגות בקנה מידה מעבדתי מהוות יתרון לייצור נשאי ליגנין פונקציונליים בעלי גדלי כוונון, יכולת אנקפסולציה גבוהה והתנהגות שחרור חוץ גופית בת קיימא תוך שימוש בהליכי אפיון פשוטים וכימיקלים ידידותיים לסביבה שיכולים למצוא יישום בתחומים שונים של מדעים ביו-רפואיים וטכנולוגיית מזון. שני פלבנואידים יושמו כמולקולות מטרה העטופות בחלקיקי הליגנין: מורין - לתוך המיקרו-חלקיקים, וקוורצטין - לתוך החלקיקים התת-מיקרוניים. ההבדל במבנים של שני הפלבנואידים הוא רק המיקום של קבוצת -OH השנייה בטבעת הארומטית B: קבוצת -OH נמצאת במיקום 2' במורין ובמיקום 3' בקוורצטין, ולכן שתי התרכובות האורגניות הן איזומרים מיקום. העובדה האחרונה מניחה התנהגות דומה של שתי התרכובות הטבעיות הביו-אקטיביות בתהליכי האנקפסולציה ו/או השחרור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה של מיקרו-חלקיקי ליגנין
- הכינו תמיסה מימית של ליגנין אלקלי במינון 50 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 2.5 גרם ליגנין אלקלי ב-50 מ"ל מים אולטרה-טהורים על מערבל מגנטי.
- הכן תמיסת טווין 80 1% על ידי המסת 1 מ"ל של טווין 80 ב 100 מ"ל של מים טהורים במיוחד.
- הכינו תמיסה של 2 M של HNO3 על ידי דילול 6.65 מ"ל של 67% HNO3 (צפיפות = 1.413 גרם / מ"ל) עם מים טהורים במיוחד לנפח סופי של 50 מ"ל.
- הוסף באיטיות 15 מ"ל של תמיסת 1% Tween 80 ל- 50 מ"ל של תמיסת ליגנין אלקלית 50 מ"ג/מ"ל.
- מערבבים את התערובת על מערבל מגנטי במהירות 500 סל"ד למשך 10 דקות, כך שחומר פעילי השטח מתפזר היטב.
- מוסיפים 20 מ"ל של 2 M HNO3 טיפה עם מזרק בקצב זרימה של כ 150 μL/s לתערובת.
- המשיכו לערבב את התערובת במשך 30 דקות כאשר התמיסה החומה הכהה הופכת לתרחיף חום בהיר של מיקרו-חלקיקים.
- מעבירים את המתלה למבחנות 1.5-2 מ"ל וצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-15,000 × גרם באולטרה-צנטריפוגה ב-10°C.
- אספו את הסופרנאטנט לניתוחים נוספים ושטפו את המיקרו-חלקיקים במים טהורים במיוחד.
- חזור על הליכי השטיפה/אולטרה-צנטריפוגה 3x.
- טבלו את המיכל עם המיקרו-חלקיקים באמבט קרח לפני ההומוגניזציה העל-קולית.
- הומוגניזציה של המיקרו-חלקיקים למשך 4 דקות בעוצמה של 93% על הומוגנייזר אולטרסאונד.
- Lyophilize microparticles בטמפרטורה של -64 ° C במייבש להקפיא ולאחסן אותם exicator לשימוש נוסף.
2. סינתזה של חלקיקי ליגנין תת-מיקרון
- הכינו תמיסה מימית של ליגנין אלקלי במינון 5 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 125 מ"ג ליגנין אלקלי ב-25 מ"ל מים אולטרה-טהורים על מערבל מגנטי.
- הוסף באיטיות 1 מ"ל של 96% EtOH לתמיסת ליגנין אלקלי.
- מערבבים את התערובת על מערבל מגנטי במהירות 500 סל"ד למשך 3 דקות.
- להכין 50 מ"ל של תמיסה 1% של חומצת לימון על ידי המסת 0.5 גרם של חומצת לימון במים טהורים במיוחד לנפח הסופי של 50 מ"ל.
- מוסיפים לתערובת 7 מ"ל של חומצת לימון 1% עם מזרק בקצב זרימה של כ-4 מ"ל/דקה.
- ממשיכים לערבב את התערובת במשך 10 דקות כאשר התמיסה השחומה והצלולה תהפוך לתרחיף חום בהיר עכור של חלקיקים תת-מיקרוניים.
- העבירו את המתלה למבחנות ולצנטריפוגות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 15,000 × גרם באולטרה-צנטריפוגה בטמפרטורה של 10°C.
- אספו את הסופרנאטנט לניתוחים נוספים ושטפו את המיקרו-חלקיקים במים טהורים במיוחד.
- חזור על הליכי השטיפה/אולטרה-צנטריפוגה 3x.
- טבלו את המיכל עם המיקרו-חלקיקים באמבט קרח לפני ההומוגניזציה העל-קולית.
- הומוגניזציה של המיקרו-חלקיקים באופן אולטרה-סאונד במשך שני מחזורים של 4 דקות כל אחד בעוצמה של 96% בהומוגנייזר אולטרסאונד.
- מצננים את המיכלים למשך דקה לאחר המחזור הראשון.
- Lyophilize microparticles בטמפרטורה של -64 ° C במייבש להקפיא ולאחסן אותם exicator לשימוש נוסף.
3. סינתזה של חלקיקי מיקרו-/תת-מיקרון טבעיים של ליגנין עטוף פלבונואידים
- חזור על שלבים 1.1-1.5 עבור המיקרו-חלקיקים.
- שוקלים 0.08 גרם של מורין, ממיסים אותו ב 1 מ"ל של EtOH, ומוסיפים תמיסה אתנולית זו לתערובת.
- מערבבים את התערובת על מערבל מגנטי במהירות 500 סל"ד למשך 20 דקות.
- מוסיפים לתערובת 20 מ"ל של 2 N HNO3 עם מזרק בקצב זרימה של כ-150 מיקרוליטר/שנייה.
- ממשיכים לערבב את התערובת במשך 60 דקות.
- חזור על שלבים 1.8-1.13.
- חזור על שלב 2.1 עבור החלקיקים התת-מיקרוניים.
- משקל 0.04 גרם של קוורצטין, להמיס אותו ב 1 מ"ל EtOH ולהוסיף תמיסה אתנולית זו לתמיסה מימית ליגנין אלקלי.
- מערבבים את התערובת על מערבל מגנטי במהירות 500 סל"ד למשך 10 דקות.
- חזור על שלבים 2.4-2.13.
4. קביעת יעילות האנקפסולציה של חלקיקי ליגנין מיקרו/סומיקרו
- חשב את התוכן של החומר הביו-אקטיבי שנוסף במהלך הליך הסינתזה של שני סוגי חלקיקי ליגנין עטופים בפלבונואידים.
- לקבוע ספקטרופוטומטרית את ספיגת הפלבנואיד בסופרנאטנט המתקבל במהלך שלבים 1.9 ו-2.8 לאחר דילול שלו עם 96% EtOH.
- חשב את ריכוז המורין/קוורצטין הלא כלוא באמצעות עקומות הכיול של הפלבנואידים.
- חשב את יעילות האנקפסולציה (EE, %) של חלקיקי הליגנין כלפי הפלבנואידים הטבעיים באמצעות משוואה (1):
(1)
כאשר wo היא הכמות הכוללת של החומר הביו-אקטיבי שנוסף (mg) ו-wf היא כמות הפלבנואיד החופשי שאינו כלוא (mg). - חשב את קיבולת טעינת התרופה (DLC, %) - פרמטר חשוב המייצג את כמות התרופה בחלקיקים ליחידת משקל של מערכת המוביל - באמצעות eq. (2):
(2)
כאשר wp היא הכמות הכוללת (התשואה) של חלקיקי ליגנין מיקרו-/תת-מיקרון המתקבלים לאחר ליופיליזציה (mg).
(1)
(2)5. אפיון חלקיקי ליגנין מיקרו ותת-מיקרון
- קביעת מספר חלקיקים, גודל והתפלגות גודל
- הערך את גודל החלקיקים ואת התפלגות גודל החלקיקים של הדגימות באמצעות מונה תאים אוטומטי עם אפשרות לספירת חרוזים. יש להוסיף עם מיקרופיפטה 1 μL של חלקיקי ליגנין/פלבנואיד מיקרו-/תת-מיקרון המתרחפים במים אולטרה-טהורים בבאר של שקופית הספירה הנדרשת לפעולה.
- המתן למספר החלקיקים ב -1 מ"ל של ההשעיה, כמו גם מספרם והתפלגותם לפי גודל שיוצגו בתצוגה של מונה התא האוטומטי.
הערה: המנגנון מאפשר אחסון הנתונים על הבזק USB. מונה התא האוטומטי תוכנה מיוחדת מאפשרת עיבוד נוסף של הקבצים הדיגיטליים והתמונות שנשמרו.
- קביעת התוכן של קבוצות חומציות/בסיסיות של חלקיקי ליגנין על ידי טיטרציה פוטנציומטרית
- משקל: 0.04 גרם של חלקיקי ליגנין לא טעונים/עטופים בפלבונואידים.
- מעבירים אותם לצלוחית ארלנמאייר, מוסיפים 10 מ"ל של 0.1 M HCl, ומניחים את הבקבוק על מערבל מגנטי ב-250 סל"ד.
- מלאו בורט 50 מ"ל בתמיסה סטנדרטית של 0.1 מ' של הטיטרנט NaOH.
- למדוד את ה- pH הראשוני של התמיסה בבקבוק Erlenmeyer עם מד pH ספסל לפני תחילת הטיטרציה.
- התחל את הטיטרציה ומדוד את ה- pH של התמיסה המנותחת לאחר כל תוספת של 0.5 מ"ל חלק מהטיטראנט.
- אחסן את נתוני הניסוי בטבלה המכילה את נפח הטיטרנט שהוחל ואת הערך המתאים של pH.
- עצור את הטיטרציה כאשר מגיעים לערך קבוע בקירוב של ה- pH על ידי הגדלת נפח תמיסת הטיטרנט.
- התווה את נתוני הניסוי בצורה של עקומות טיטרציה דיפרנציאליות אפס, ראשונה ושנייה.
- קבע את הנקודות השקוות ואת הנפחים המקבילים המתאימים של הטיטראנטים שבהם נעשה שימוש.
- חשב את התוכן של הקבוצות הבסיסיות החומציות A, aו - Abעל פני השטח של חלקיקי ליגנין פרוקים וטעונים בפלבונואידים באמצעות משוואות (3) ו- (4):
MGEQ/גרם (3),
מגק/גרם (4)
כאשר Veqi הוא הנפח המקביל (mL); NT את הנורמליות של titrant (mgeqv / mL); VT נפח הטיטרנט המשמש להליך הקביעה (מ"ל); מ משקל המדגם המנותח (G).
- קביעת נקודת ה-pH של מטען אפס (pHPZC) של חלקיקים מבוססי ליגנין בשיטת החיבור המוצק.
- להכין 60 מ"ל של 0.1 M תמיסה מימית של NaCl.
- הוסף 9 מ"ל של תמיסת 0.1 M NaCl בכל אחת מחמש צלוחיות חרוטיות עצורות והתאם את ה- pH ל- pHi = 2, 4, 7, 10 ו- 12 (כאשר i = 1-5 מציין את מספר התמיסה המתאימה), בהתאמה על ידי תוספת של 0.1 M HCl או 0.1 M NaOH. התאם את הנפח הכולל של התמיסה בכל בקבוק ל -10 מ"ל בדיוק על ידי הוספת תמיסת NaCl באותו כוח.
- הוסיפו 40 מ"ג של חלקיקי ליגנין יבשים (מיקרו-/תת-מיקרון טעונים בפלבונואיד) לכל בקבוק וסגרו היטב את הצלוחיות.
- אבטחו את הצלוחיות זקופות על שייקר מסלולי, והשאירו אותן רועדות במשך 24 שעות.
- אפשר שיווי משקל למשך 30 דקות ולאחר מכן מדוד את ה- pH הסופי (pHf) של הסופרנאטנטים בכל בקבוק.
- התווה ערכי pHf כנגד ערכי ה- pH הראשוניים המתאימים (pHi).
- נקודת האפס (pHPZC) מוגדרת כערך ה-pH שבו העקומה ΔpH לעומת pHi חותכת את הקו הישר עם קואורדינטות (pHi; pHi).
- קביעת התוכן הפנולי הכולל (TPC) של חלקיקי ליגנין
הערה: התוכן הפנולי הכולל (TPC) של חלקיקי ליגנין מיקרו-/תת-מיקרון נקבע באמצעות שיטה קולורימטרית Folin-Ciocalteu שונה.- מערבבים 200 μL של תרחיף מימי של חלקיקים עם ריכוז של 500 מיקרוגרם / מ"ל עם 600 μL של מים טהורים במיוחד ו 200 μL של מגיב Folin-Ciocalteu (1: 1, v/v).
- לאחר 5 דקות, הוסיפו 1.0 מ"ל של 8% Na2CO3 ו-1.0 מ"ל של מי מילי-Q לתערובת ודגרו עליהם בחושך ב-40°C למשך 30 דקות באמבט מים עם תסיסה לסירוגין.
- צנטריפוגה את המתלים ב 5,300 × גרם למשך 2 דקות.
- הכינו ריק שאינו מכיל חלקיקים.
- מעבירים 3.5 מ"ל של הסופרנאטנט בקובט קוורץ 10 מ"מ ומודדים את הספיגה בספקטרופוטומטר UV/Vis באזור הנראה ב-760 ננומטר כנגד החסר.
- הכינו עקומת כיול של החומצה הגאלית הסטנדרטית לפי השלבים 5.3.1-5.3.5; רק במקום 200 μL של השעיית חלקיקי ליגנין, השתמש בתמיסה אתנולית של חומצה גאלית עם ריכוזים התחלתיים של 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ו 200 מיקרוגרם / מ"ל.
- בטא את נתוני הניסוי של המיקרו-חלקיקים כ-mg של חומצה גאלית שווה ערך במיליגרם לגרם של דגימה יבשה (mg GAE/g).
- חישוב TPC באמצעות משוואה (5):
מ"ג GAE/גרם (5)
כאשר CGA הוא ריכוז הדגימה שווה ערך לריכוז החומצה הגאלית הסטנדרטית המתקבלת מחלקת הכיול של החומצה (μg GA/mL); Cs הוא ריכוז הדגימה, השווה למסת הדגימה היבשה חלקי נפח הממס (מק"ג/מ"ל).
MGEQ/גרם (3),
מגק/גרם (4)
מ"ג GAE/גרם (5)6. קביעת יכולת השחרור במבחנה של חלקיקי ליגנין
- הכן 250 מ"ל של מדיום קיבה מדומה ללא אנזימים על ידי התאמת ה- pH של תמיסת PBS סטנדרטית עם 0.1 M HCl ל- pH = 1.2.
- הכן 250 מ"ל של כל אחת משתי תמיסות נוזלי המעי המדומות על ידי התאמת ה- pH של תמיסת PBS סטנדרטית עם 0.1 M NaOH / 0.1 M HCl ל- pH = 6.8 ו- 7.4, בהתאמה.
- הוסף 25 מ"ג של חלקיקי מיקרו-/תת-מיקרון בעטוף פלבונואיד ל-50 מ"ל של תווך קיבה מדומה נטול אנזימים בכור אצווה מזכוכית המסופק עם מערבל מכני והכנס אותו לאמבט מים תרמיים בטמפרטורה קבועה של T = 37 ± 0.2 oC.
- טובלים את המערבל לעומק של 2/3 מנפח הנוזל כדי להבטיח ערבוב מלא של הפאזה המוצקה והנוזלית ולהבטיח העברת מסה מקסימלית ללא אזורים עומדים.
- הוציאו 1 מ"ל דגימה מהכור כל 10 דקות עד לדקהה-90 ומיד פיפטה 1 מ"ל של תמיסת נוזלים מדומה טרייה לתוך הכור כדי למנוע שינוי בנפח הכולל ולהבטיח תנאי כיור.
- חזור על אותו הליך כולל שלבים 6.3-6.6 עם שתי תמיסות נוזל המעי המדומות עם pH = 6.8 ו- 7.4, בהתאמה, למשך 200 דקות.
- בצע ניסויים מקבילים עם חלקיקי ליגנין שנפרקו בשלושת המדיות המדומות והשתמש בדגימות כריקות לאפס את הספקטרופוטומטר.
- קבע את ספיגת הדגימות באופן ספקטרופוטומטרי לאחר סינון הדגימות ודילולן עם 96% EtOH כנגד הדגימות הריקות משלב 6.7 וחשב את ריכוז הפלבנואידים המתאים באמצעות עקומות הכיול המתאימות של מורין המתקבלות ב- pH = 1.2, 6.8 ו- 7.4, בהתאמה.
- חשב את השחרור המצטבר (CR) של הביופלבנואידים באמצעות משוואה (6) במק"ג/מ"ל ואחוז השחרור המצטבר (CRP) לפי משוואה (7):
(6)
כאשר Ci ו- Ci+1 הם ריכוזי מורין/קוורצטין בדגימות ith ו- (i+1)th (μg/mL); Vs נפח הדגימה שנלקח מכור האצווה (מ"ל); V הנפח הכולל של המדיה המדומה (mL).
(7)
כאשר Cmax הוא הריכוז המרבי של החומר הפעיל ביולוגית בנשא (מיקרוגרם / מ"ל).
(6)
(7)7. ניתוחים סטטיסטיים
- לבטא את נתוני הניסוי כאמצעי ± סטיות תקן (SD) של שלוש מדידות בלתי תלויות.
- לקבוע את המובהקות הסטטיסטית של תוצאות הניסוי על ידי ביצוע מבחן ANOVA כמבחן פוסט-הוק. שקול ערך של p < 0.05 מובהק סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טכניקה נגד משקעים ממסים בוצעה כדי לייצר חלקיקי מיקרו / תת-מיקרון ליגנין אלקליים. תמיסה מימית של חומצה אנאורגנית-חומצה חנקתית/חומצה אורגנית-חומצת לימון פוזרה לתמיסה מימית של ליגנין אלקלי, מועשרת בסורפקטנט/אתנול ידידותי לסביבה, מה שהביא למשקעים הדרגתיים של המומס הביופולימרי, ולאחר סוניקציה נוצר לבסוף תרחיף של חלקיקי מיקרו/תת-מיקרון קומפקטיים (איור 1).
איור 1: הומוגניזציה של חלקיקי ליגנין. (A) הומוגניזציה על-קולית של חלקיקי ליגנין תת-מיקרוניים מסונתזים; (B) מיקרו-חלקיקי ליגנין הומוגניים טעונים במורין ופרוקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
נקבעו התפלגות הגודל, המספר והגודל של המיקרו-נשאים של ליגנין שנפרקו והיו עטופים במורין (איור 2). נתוני הניסוי הוכיחו ריכוז גבוה יותר, 1 × 107 חלקיקים/מ"ל (2,037 חלקיקים/μL), וגודל ממוצע גבוה יותר, 6.1 מיקרומטר, של מיקרו-נשאים עמוסי ביופלבונואידים (איור 2B) מאשר אלה שנפרקו עם ריכוז של 7.4 ×10 6 חלקיקים/מ"ל (1,474 חלקיקים/μL) וגודל ממוצע של 5.7 מיקרומטר (איור 2A). התפלגות הגודל באחוזים של שני סוגי החלקיקים בטווח המידות 3-6 מיקרומטר הייתה 75.2% עבור החלקיקים שנפרקו ו-69.3% עבור המיקרו-נשאים הכמוסים במורין ו-20.2% ו-25.2%, בהתאמה, בטווח של 7-10 מיקרומטר. הכמות, הריכוז וקצב הזרימה של האנטי-ממס, חומצה חנקתית, חיוניים לגודל החלקיקים. הריכוז הגבוה יותר והכמות הגדולה יותר של החומצה מובילים לחלקיקים גדולים יותר, בעוד שקצב הזרימה הגבוה יותר מעורר צבירה של התרחיף.
איור 2: התפלגות גודל חלקיקים. (A) התפלגות גודל בפועל של מיקרו-חלקיקי ליגנין שנפרקו ב-1 מיקרוליטר של תוכנת ההשעיה של מונה החלקיקים; (B) התפלגות גודל בפועל של מיקרו-חלקיקים אלקליים ליגנין עטופים במורין ב-1 מיקרוליטר של תוכנת ההשעיה של מונה החלקיקים. (C) צילום מיקרוסקופי מונה חלקיקים של התפלגות חלקיקי הליגנין שנפרקו; (D) צילום מיקרוסקופי מונה חלקיקים של התפלגות המיקרו-חלקיקים האלקליים ליגנין המוקפסים במורין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 מציג את ספקטרום ספיגת UV/Vis של תמיסות אתנול מורין, תמיסות מימיות של ליגנין אלקלי ואת התערובות המכילות מורין וליגנין עם ריכוזים התחלתיים שונים. כמובן, שיאי הספיגה של ליגנין טהור וביופלבנואיד אינם חופפים וההטרופולימר אינו מפעיל כל השפעה משבשת במהלך השיטה הספקטרופוטומטרית המיושמת לקביעת ריכוז מורין בשלב הנוזלי לאחר אנקפסולציה של הפלבנואיד לתוך מיקרו-נשאים פולימריים ובמהלך ניסויי שחרור חוץ גופי . הספיגה המרבית של מורין בתערובת הדו-מרכיבית עברה לאורך גל גבוה יותר, מ-λmax = 359 ננומטר ל-λmax = 395 ננומטר, כתוצאה מה-pH המוגבר של המדיום עקב נוכחות ליגנין אלקלי. הסטייה האחרונה של מקסימום הספיגה באזור הנראה עוררה את הצורך בתכנון עקומות כיול של מורין בערכי pH שונים של התווך (איור 4A). שלוש העקומות הסטנדרטיות המאופיינות במתאמים ליניאריים חזקים מאוד הוכחו על ידי הערכים הגבוהים של מקדמי הרגרסיה (R2 > 0.99) בטווח ריכוז מורין Co = 2.5-100 מיקרוגרם / מ"ל. באופן דומה, שלוש העקומות הסטנדרטיות של קוורצטין בשלושת התאים הפיזיולוגיים המדומים, שהוצגו באיור 4B, הראו ליניאריות גבוהה באותו טווח ריכוז.
איור 3: השוואה בין ספקטרום UV/Vis של תמיסות אתנוליות של מורין, תמיסות מימיות של ליגנין אלקלי ותערובות המכילות מורין וליגנין עם ריכוזים התחלתיים שונים. הספקטרום של ליגנין טהור ומורין אינו חופף, וההטרופולימר אינו מפעיל כל השפעה מפריעה. הוספת ליגנין למורין מובילה להסטת הבליעה המרבית של מורין לאורך גל גבוה יותר, מ-λmax = 359 ננומטר ל-λmax = 395 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: עקומות כיול של תמיסות פלבנואידים אתנוליות. (A) מורין ו-(B) קוורצטין בטווח הריכוזים Co = 2.5-100 מיקרוגרם/מ"ל ב-pH=1.2 (בכחול) (מקביל לנוזל קיבה מדומה), pH=6.8 (באדום) (מקביל לנוזל מעי דק מדומה), ו-pH=7.4 (בירוק) (מקביל לנוזל מעי גס מדומה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
הריכוז היחסי של אתרים פעילים חומציים ובסיסיים / קבוצות פונקציונליות על פני השטח של חלקיקי ליגנין אלקליים שנפרקו וטעונים נקבע על ידי טיטרציה פוטנציומטרית. החישובים התבססו על נפחי הטיטרנט השקולים שנקבעו על ידי עקומות הטיטרציה הדיפרנציאליות הנגזרות השניות (איור 5). הערכים של pKa שנקבע, ריכוזים של קבוצות פונקציונליות חומציות (חזקות, חלשות, סה"כ), ו- pH ו- pHpzc של חלקיקי מיקרו ותת-מיקרון מוצגים בטבלה 1.
איור 5: עקומות טיטרציה פוטנציומטריות דיפרנציאליות נגזרות שניות של חלקיקי הליגנין מיקרו/תת-מיקרון שנפרקו ונטענו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| פרמטר | מיקרו-חלקיקי ליגנין | מיקרו-חלקיקי ליגנין עטופים במורין | חלקיקי ליגנין תת-מיקרוניים | חלקיקי ליגנין תת-מיקרוניים בעטוף קוורצטין |
| Veq., מ"ל | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (חזק), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (חלש), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (סה"כ), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (תרחיף מימי) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pHpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
טבלה 1: ערכים של הנפח המקביל של טיטרנט (Veq), הבסיס השלילי -10 לוגריתם של קבוע הדיסוציאציה החומצית (pKa), ריכוזים של קבוצות פונקציונליות חומציות (חזקות, חלשות, סה"כ) (Aa, mgeq/g), pH ונקודת מטען אפס (pH pzc) של חלקיקי הליגנין מיקרו ותת-מיקרון שנפרקו ונטענו. חלקיקי הליגנין הזעירים והתת-מיקרוניים, הפרוקים והעמוסים בפלבונואידים טעונים שלילית מכיוון שה- pH שלהם >-pH pzc.
התוכן הפנולי הכולל (TPC), שנקבע על ידי שיטה קולורימטרית Folin-Ciocalteu שונה וחושב כשווה ערך לחומצה גאלית, היה 78.2 מ"ג GAE/g של חלקיקי ליגנין שנפרקו, בעוד שהערך של TPC של מיקרו-נשאים עטופים במורין עם ריכוז זהה היה גבוה פי 2.3 (183.43 מ"ג GAE/g). האחרון מצביע על כך שהחלקיקים הביופולימרים ההטרו מועשרים בקבוצות פנוליות נוספות עקב שילוב מולקולות הפלבנואידים. יעילות האנקפסולציה של פלבנואידים הייתה: 98.1% עבור מורין ו-97.6% עבור קוורצטין. יכולות האנקפסולציה של התרופה היו 28.2% עבור המיקרו-חלקיקים המועתנים במורין ו-39.0% עבור חלקיקי תת-מיקרון בעטוף קוורצטין.
השחרור המצטבר במבחנה של מורין וקוורצטין נחקר במדיה מדומה נטולת אנזימים במערכת העיכול: נוזלי קיבה, מעי דק ומעי גס ב-pH = 1.2, 6.8 ו-7.4, בהתאמה (איור 6). יעילות השחרור הגבוהה ביותר של כ -24% הושגה לאחר 30-40 דקות ב- pH = 6.8. על פי תוצאות הניסוי, כמות הפלבנואיד ששוחרר בתווך המעי הדק המדומה הייתה כפולה מזו ששוחררה בסביבת המעי הגס המדומה ופי שלושה מיעילות השחרור שנקבעה בקיבה. הרמה הגבוהה ביותר של שחרור קוורצטין שנקבעה ב-SIFב-pH = 7.4 בדקה ה-70-90 הייתה 34%, אשר עלתה על השחרור המצטבר של הפלבנואיד ב-SGF (pH = 1.2) וב-SIF (pH=6.8) ב-23.5% וב-18%, בצורה מכובדת.
איור 6: ניתוחים השוואתיים של יעילות השחרור המצטבר במבחנה של מורין וקוורצטין מחלקיקי ליגנין מיקרו ותת-מיקרון במדיה פיזיולוגית מדומה. הרמה הגבוהה ביותר של שחרור מורין הושגה בתווך מדומה של המעי הדק. יעילות השחרור הגבוהה ביותר של קוורצטין נרשמה בהדמיה של נוזל המעי הגס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בין הנושאים הקריטיים העיקריים של מתודולוגיות סינתזה מודרניות לתכנון פורמולציות נושאות תרופות המבוססות על ביופולימרים הוא יישום ריאגנטים אורגניים מסוכנים - ממיסים נדיפים ודליקים, כגון טטרהידרופורן, אצטון, מתנול ואפילו DMSO בריכוזים גבוהים - המגביל את תחולתם בביו-רפואה, בתעשיית התרופות ובטכנולוגיית המזון בשל ביטוי השפעות רעילות אפשריות20, 21,22,23,24. נקודה מכרעת נוספת היא מעורבות של תגובות כימיות מסובכות (למשל, אסטריפיקציה, פילמור) או מכשירים יקרים במהלך הליך הסינתזה. שתי הטכניקות המוצגות בכתב היד הנוכחי מתגברות על המגבלות האחרונות על ידי השלכה של ממסים חלופיים (מים) ותרכובות לא רעילות כגון חומרים פעילי שטח (Tween 80) וחומרים צולבים (אתנול, חומצת לימון), ומסווגות אותם כשיטות סינתזה "ירוקות". יתר על כן, המתודולוגיות מציעות פתרון המספק את הצורך והדחף הקריטיים לפיתוח הליכים זולים, ידידותיים לסביבה וברי קיימא לתכנון חלקיקי ליגנין, המשמשים כתבניות נשא מתכלות, ביו-אקטיביות ותואמות ביולוגית של חומרים פעילים פיזיולוגית25.
כדי לקבל חלקיקי ליגנין בגודל הרצוי, נבחרו שני תנאי ייצור: אחד עם ריכוז ליגנין גבוה (50 גרם / ליטר) וחומצה חנקתית כחומר נוגד ממס והשני עם ריכוז ליגנין נמוך יותר (5 גרם / ליטר), אתנול כממס, וחומצת לימון הממלאת תפקיד כפול של נוגד ממס וסוכן קישור צולב בו זמנית, שכן אלה היו שני המשתנים המשפיעים על גודל חלקיקי ליגנין. קצב הזרימה במהלך שני ההליכים נשמר נמוך כדי לספק חלקיקים קטנים יותר ולמנוע את הצטברותם. ישנן כמה נקודות קריטיות שיש לקחת בחשבון לגבי בחירת החומצות האנאורגניות והאורגניות עבור פרוטוקולי הסינתזה.
חומצה חנקתית נבחרה משום שהיא חומצה אנאורגנית חזקה, המציעה כמות משקעים גבוהה של ליגנין אלקלי, ועל ידי שליטה בקצב התוספת שלה חלקיקים בטווח הגודל הרצוי ניתן להשיג. יתר על כן, צפוי כי תוספת של HNO3 יכולה לספק שינוי של חלקיקים הטרופולימרים עקב שינויים כימיים סבירים של מבנה ליגנין הקשורים ל: תהליכים של תגובות חנקה-החלפה של אטומי H בטבעות בנזן עם קבוצות -NO 2 ; אסטריפיקציה של קבוצות אליפטיות -OH והיווצרות קבוצות פונקציונליות אסטר; ו/או חמצון של קבוצות פנוליות -OH ו-OCH3 וכתוצאה מכך היווצרות מבני קינון. באשר לתפקיד המשקע וריכוז הליגנין לגודל החלקיקים המסונתזים, מצד אחד, ריכוז הליגנין הראשוני הגבוה יותר בשילוב עם תוספת החומצה החנקתית החזקה (pKa = -1.4) והמסיסות המוגבלת של ההטרופולימר האלקלי בחומצה האי-אורגנית הובילו לייצור חלקיקים בתחום המיקרומטר. מצד שני, תוספת אתנול לתמיסה מימית של ליגנין אלקלי עם ריכוז נמוך יותר מעורר היווצרות של השעיה בסדר בשל מסיסות חלקית של ליגנין אלקלי באלכוהול. יתר על כן, התוספת שלאחר מכן של חומצת לימון הובילה לייצור חלקיקים בטווח הננומטרי מכיוון שהחומצה האורגנית חלשה יותר (pKa1 = 3.13) מחומצה חנקתית, וכתוצאה מכך מציעה כמות משקעים נמוכה יותר.
כמה תכונות בסיסיות של תרופות ננומטריות הן מחזור תרופות, שחרור תרופות מצורות מינון באתרים ספציפיים, וספיגה דרך ממברנות ביולוגיות. תכונות אלה מושפעות במידה ניכרת מכמה מאפיינים פיזיקליים וכימיים של נשאי הננו-חלקיקים וממולקולות התרופה העטופות.
המאפיינים הפיזיקוכימיים של נשאים ביופולימרים: ריכוז קבוצות חומציות ובסיסיות פעילות על פני השטח, נקודת אפס מטען (pHPZC), גודל, התפלגות גודל חלקיקים, כמו גם המאפיינים הספקטרליים של החלקיקים לפני ואחרי שילוב החומר הביו-אקטיבי, הם פרמטרים חיוניים שיש לקחת בחשבון בעת הערכת הקבוצות הפונקציונליות, תגובתיות, יציבות, והומוגניות של חלקיקים10.
גודל חלקיקים, התפלגות גודל חלקיקים, מטען ומורפולוגיה הם בין הגורמים העיקריים המשפיעים על הערכות אלה. גודל החלקיקים משפיע על יציבותם, תגובתם והתנהגות שחרור התרופות שלהם26. חלקיקים קטנים יותר מציעים שטח העברה המוני גדול יותר, מה שמוביל לקצב שחרור תרופות גבוה יותר. לעומת זאת, שטח הפנים הקטן יותר של העברת מסה של חלקיקים גדולים יותר גורם לקצב נמוך יותר של פיזור תרופות בתוך חלקיקים אלה.
היישום של שיטות טיטרימטריות כטכניקות בסיסיות לקביעת אתרים חומציים ובסיסיים וקבוצות פונקציונליות הקיימות על משטחים מוצקים מתרחב בהתמדה. היתרונות העיקריים של טיטרציה פוטנציומטרית כוללים חיסכון בזמן ובעבודה, דיוק גבוה וביטול תקני ייחוס ומכשירים יקרים. השיטה יושמה במחקר הנוכחי מכיוון שהיא מאפשרת אפיון של חלקיקים ביופולימרים על ידי קביעה איכותית וכמותית למחצה של אופי ומספר האתרים הפעילים הקיימים על פני השטח של נשאי ביופולימרים טעונים ופרומים27.
מטען פני השטח של נשאי מיקרו/ננו ביולוגיים ורפואיים ממלא תפקיד חשוב בספיגת תאים28. ה- pHPZC מתאים לצפיפות מטען פני השטח אפס, כלומר, לכמויות שוות ערך של מטענים שליליים וחיוביים שפותחו על ידי שיווי משקל פרוטונים. קביעת ערכים אלה מספקת מידע על הספציפיות של ספיחה29. עם זאת, מכיוון שהפרמטר איזואלקטרי מייצג רק את מטעני השטח החיצוניים של חלקיקים בתרחיף, בעוד שנקודת האפס משתנה בתגובה למטען פני השטח נטו הכולל (חיצוני ופנימי) של החלקיקים, פרוטוקולpH pzc יושם לראשונה במחקר הנוכחי כשיטה פשוטה ויעילה לאפיון נשאי תרופות ביופולימרים. על פי הרעיון של pHpzc, ב- pH מעלpH pzc, פני השטח של חלקיקי הביופולימר טעונים בעיקר שלילית, בעוד מטען חיובי נטו נצפה כאשר ה- pH של המתלה הוא מתחת ל-pH pzc. מנתוני הניסוי המוצגים בטבלה 1, ניתן להסיק כי חלקיקי הליגנין הזעירים והתת-מיקרוניים, הלא טעונים וטעונים בפלבונואידים טעונים שלילית, משום שה-pH שלהם >-pH pzc.
יעילות העמסת הפלבנואידים מושפעת מיעילות האנקפסולציה ומיכולת העמסת התרופות. יעילות אנקפסולציה (E, %) מוגדרת כיחס בין כמות התרופה המשולבת בחלקיקים לכמות הכוללת בפורמולציה. יעילות האנקפסולציה מושפעת ממאפייני התרופה, הממס והנשא30.
עם זאת, העברה יעילה של חומר פעיל פיזיולוגית תלויה באופן ובמידה שבה המולקולות שלו משתחררות מהמטריצה הנשאית. לכן, חשוב מאוד לשקול את מנגנון שחרור התרופה ואת שיעור השחרור 31,32,33. על ידי הבהרת מנגנון השחרור במבחנה של ביופלבנואידים מהמיקרו/ננו-נשאים הביופולימריים שלהם, ניתן לדמות ולחזות את ההתנהגות של הפלבנואיד והנשא בתווך פיזיולוגי אמיתי ולייעל את התכנון של פורמולציות פרמצבטיות עם זמינות ביולוגית משופרת. תוצאות הניסוי במבחנה שהתקבלו במחקר זה שימושיות לפרקטיקה קלינית מכיוון שהן מוכיחות כי בשל ההיקף הנמוך יותר של שחרור מורין/קוורצטין מליגנין תת-מיקרון ומיקרו-חלקיקים בסביבת הקיבה, חלקיקי הביופולימר החדשניים מתאימים למתן פומי בשל הסיכון הנמוך יותר לגירוי בקיבה בהשוואה למתן פומי ישיר של החומרים הביו-אקטיביים. המיקרו-חלקיקים הביופולימרים החדשניים מתאימים למתן פומי בשל הסיכון הנמוך יותר לגירוי בקיבה בהשוואה למתן פומי ישיר של החומרים הביו-אקטיביים. יתר על כן, החלקיקים התת-מיקרוניים, בשל גודלם הקטן ופוטנציאל השחרור המשמעותי שלהם, יכולים להיות מיושמים כפורמולציות הניתנות להזרקה. בנוסף, נשאי הליגנין הזעירים והתת-מיקרוניים החדשים מציעים הזדמנות להתגבר על המגבלות שדווחו על ידי מדענים אחרים הקשורים לקשיים הקשורים למתן אוראלי של מינונים גבוהים של ביופלבנואידים מסוימים, הנובעים מנטייתם ליצור תמיסות רוויות במערכת העיכול, אשר בתורן מעכבות את תהליך הפירוק ואת ספיגתם היעילה.
קלות הסינתזה, התאימות הביולוגית של החלקיקים המתקבלים, כמו גם האפשרות להתאמה אישית של הפרוטוקול הנוכחי, מייצגים את היתרונות העיקריים של המתודולוגיה המוצגת. גודל החלקיקים הוא אופטימלי עבור היישומים המיועדים שלהם, ומציע מספיק שטח פנים זמין עבור קבצים מצורפים של טיפולים ומיקוד moieties, אשר בתורו אינו דורש חלקיקים נוספים להיות מנוהל כדי להשיג דרישות מינון היעד. השימוש בליגנין כמטריצה הטרופולימרית בסיסית לסינתזה של חלקיקים חדשניים מאפשר תאימות ביולוגית מוגברת ומציע לקבוצות פונקציונליות פעילות שונות המציגות הזדמנויות להתאמה אישית של החלקיקים עבור יישומים מגוונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי הקרן המדעית הבולגרית תחת חוזה מספר KΠ-06 H59/3 ועל ידי פרויקט מדעי מס '07/2023 FVM, אוניברסיטת טרקיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
References
- Yu, X., et al. Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics. ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).
- Boarino, A., Klok, H. -A. Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications. Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).
- Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging. Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).
- Sharma, S., et al. Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application. Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041 (2022).
- Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T.
- Beaucamp, A., et al. Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review). Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).
- Antunes, F., et al. From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application. Int J Biol Macromol. 234, 123592 (2023).
- Garg, J., et al. Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update. Materials Letters. 311, 131573 (2022).
- Anushikha, K. K. Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications. Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).
- Freitas, F. M. C., et al. synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment. Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).
- Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus. Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070 (2020).
- Worku, L. A., et al. Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application. Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793 (2023).
- Gala Morena, A., Tzanov, T. z Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials. Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).
- Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative. Int J Mol Sci. 24 (16), 12705 (2023).
- Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity. Pharmaceutics. 15 (4), 1067 (2023).
- Yaneva, Z., et al. Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity. Antibiotics. 11, 650 (2022).
- Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications. Polymers. 15 (6), 1487 (2023).
- Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).
- Tang, Q., et al. Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications. Polymers. 12 (11), Basel. 2471 (2020).
- Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin. Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).
- Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate. Food Res Int. 66, 93-99 (2014).
- Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. Lignin from micro- to nanosize: Applications. Int. J. Mol. Sci. 18, 2367 (2017).
- Mishra, P. K., Ekielski, A. A simple method to synthesize lignin nanoparticles. Colloids Interfaces. 3, 52 (2019).
- Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor. Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).
- Tardy, B. L., et al. Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules. Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).
- Silva, M., et al. Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies. J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).
- Georgieva, N., Yaneva, Z. Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study. Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).
- Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. Charge reversal nano-systems for tumor therapy. J Nanobiotechnol. 20, 31 (2022).
- Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).
- Zatorska, M., et al. Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study. Int J Pharmaceutics. 591, 120031 (2020).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).
- Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass. Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).
