Summary
Vi beskriver nya, enkla metoder för syntes och karakterisering av biokompatibla ligninmikro- och submikronpartiklar. Dessa formuleringar ger ett enkelt tillvägagångssätt för användning av heteropolymeren, samt ett alternativ för rationell design av multifunktionella bärarmatriser med potentiell tillämpbarhet inom biomedicin, läkemedelsteknologi och livsmedelsindustrin.
Abstract
Tillämpligheten av biopolymer mikro-/nanoteknik inom human-, veterinärmedicin-, läkemedels- och livsmedelsteknik växer snabbt på grund av den stora potentialen hos biopolymerbaserade partiklar som effektiva bärarsystem. Användningen av lignin som en grundläggande heteropolymerbiomatris för design av innovativa mikro-/submikronformuleringar möjliggör uppnående av ökad biokompatibilitet och erbjuder olika aktiva funktionella grupper, vilket ger möjligheter till anpassning av formuleringarnas fysikalisk-kemiska egenskaper och bioaktiviteter för olika applikationer. Syftet med denna studie var att utveckla en enkel och miljövänlig metodik för syntes av ligninpartiklar med mikro- och submikronstorlek; att utvärdera deras fysikalisk-kemiska, spektrala och strukturella egenskaper; och att undersöka deras förmåga till inkapsling av biologiskt aktiva molekyler och potential för in vitro-frisättning av bioflavonoider i simulerade gastrointestinala medier. De presenterade metoderna använder billiga och gröna lösningsmedel; Enkla, okomplicerade, snabba och känsliga processer som kräver lite utrustning, giftfria ämnen och enkla metoder för deras karakterisering, bestämning av inkapslingsförmåga mot de dåligt vattenlösliga bioaktiva föreningarna Morin och Quercetin, och in vitro-frisättningspotentialen hos ligninmatriserna.
Introduction
Numera har benägenheten mot biopolymerer som cellulosa, kitosan, kollagen, dextran, gelatin och lignin som prekursorer för design av mikro-/submikronbärare med anpassningsbar storlek, fysikalisk-kemiska egenskaper och biofunktionaliteter ökat inom den biomedicinska, farmaceutiska och livsmedelstekniska industrin på grund av deras tillämplighet inom vävnadsteknik, 3D-bioprinting, in vitro Plattformar för sjukdomsmodellering, förpackningsindustri, beredning av emulsion och näringstillförsel bland annat 1,2,3.
Nya studier belyser aspekterna av ligninbaserade hydrogeler samt mikro- och nanoformuleringar4 som fördelaktiga vehikler som används för livsmedelsförpackningsmaterial5, energilagring6, kosmetika7, termiska/ljusstabilisatorer, förstärkta material och läkemedelsbärarmatriser8 för leverans av hydrofoba molekyler, förbättring av UV-barriärer9, som förstärkningsmedel i nanokompositer och som ett alternativ till oorganiska nanopartiklar på grund av vissa säkerhetsproblem på senare tid 10,11,12. Anledningen till denna tendens är biokompatibiliteten, den biologiska nedbrytbarheten och icke-toxiciteten hos den naturliga heterobiopolymeren, såväl som dess bevisade bioaktiviteter med lignin-antioxidantpotential och radikalrensande, antiproliferativa och antimikrobiella aktiviteter 13,14,15,16,17.
Vetenskaplig litteratur rapporterar olika metoder för syntes (självorganisering, utfällning mot lösningsmedel, sur utfällning och lösningsmedelsskiftning)18 och karakterisering av ligninbaserade formuleringar i mikro-/nanoskala, inklusive applicering av dyra eller skadliga lösningsmedel som tetrahydrofuran (THF), dimetylsulfoxid (DMSO), N,N-dimetylformamid (DMF) och aceton, och komplicerade, indirekta och tråkiga processer som använder mycket utrustning och giftiga ämnen 12,19,20.
För att övervinna de senare nackdelarna presenterar följande protokoll nya metoder för syntes av ligninbaserade mikro-/submikronpartiklar med hjälp av billiga och gröna lösningsmedel; Enkla, okomplicerade, snabba och känsliga processer som kräver lite utrustning, giftfria ämnen och enkla metoder för deras karakterisering och bestämning av inkapslingsförmåga mot dåligt vattenlösliga bioaktiva föreningar och in vitro-frisättningspotential hos ligninmatriserna. De presenterade produktionsmetoderna i labbskala är fördelaktiga för tillverkning av funktionella ligninbärare med justerbara storlekar, hög inkapslingsförmåga och hållbart in vitro-frisättningsbeteende med hjälp av enkla karakteriseringsprocedurer och miljövänliga kemikalier som kan hitta tillämpning inom olika områden av biomedicinska vetenskaper och livsmedelsteknik. Två flavonoider applicerades som målmolekyler inkapslade i ligninpartiklarna: morin-in i mikropartiklarna och quercetin-in i submikronpartiklarna. Skillnaden i strukturerna för båda flavonoiderna är bara positionen för den andra -OH-gruppen i den B-aromatiska ringen: -OH-gruppen är på 2'-positionen i morin och på 3'-positionen i quercetin, så båda organiska föreningarna är positionsisomerer. Det senare förutsätter liknande beteende hos båda bioaktiva naturliga föreningar i inkapslings- och/eller frisättningsprocesserna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntes av ligninmikropartiklar
- Bered en 50 mg/ml vattenlösning av alkalilignin genom att lösa upp 2,5 g alkalilignin i 50 ml ultrarent vatten på en magnetomrörare.
- Bered 1 % Tween 80-lösning genom att lösa upp 1 ml Tween 80 i 100 ml ultrarent vatten.
- Bered en 2 M lösning av HNO3 genom att späda 6,65 ml 67 % HNO3 (densitet = 1,413 g/ml) med ultrarent vatten till en slutlig volym av 50 ml.
- Tillsätt långsamt 15 ml av 1 % Tween 80-lösning till 50 ml av 50 mg/ml alkaliligninlösning.
- Rör om blandningen på en magnetomrörare vid 500 rpm i 10 minuter så att det ytaktiva ämnet blir väl dispergerat.
- Tillsätt 20 ml 2 M HNO3 droppvis med en spruta med en flödeshastighet på cirka 150 μL/s till blandningen.
- Fortsätt röra om blandningen i 30 minuter när den mörkbruna lösningen har omvandlats till en ljusbrun suspension av mikropartiklar.
- Överför suspensionen till 1,5-2 ml provrör och centrifugera i 30 minuter vid 15 000 × g i en ultracentrifug vid 10 °C.
- Samla in supernatanten för ytterligare analyser och skölj mikropartiklarna med ultrarent vatten.
- Upprepa sköljning/ultracentrifugering 3x.
- Doppa behållaren med mikropartiklarna i ett isbad före ultraljudshomogeniseringen.
- Homogenisera mikropartiklarna i 4 minuter med en intensitet på 93 % på en ultraljudshomogenisator.
- Frystorka mikropartiklarna vid en temperatur på -64 °C i en frystork och förvara dem i en exicator för vidare användning.
2. Syntes av lignin submikrona partiklar
- Bered en vattenlösning av alkalilignin på 5 mg/ml genom att lösa upp 125 mg alkalilignin i 25 ml ultrarent vatten på en magnetomrörare.
- Tillsätt långsamt 1 ml 96% EtOH till alkaliligninlösningen.
- Rör om blandningen på en magnetomrörare vid 500 rpm i 3 min.
- Förbered 50 ml av en 1% lösning av citronsyra genom att lösa upp 0,5 g citronsyra i ultrarent vatten till en slutlig volym på 50 ml.
- Tillsätt 7 ml 1 % citronsyra droppvis med en spruta med en flödeshastighet på cirka 4 ml/min till blandningen.
- Fortsätt röra om blandningen i 10 minuter när den bruna klara lösningen förvandlas till en grumlig ljusbrun suspension av submikronpartiklar.
- Överför suspensionen till provrör och centrifugera i 30 minuter vid 15 000 × g i en ultracentrifug vid 10 °C.
- Samla in supernatanten för ytterligare analyser och skölj mikropartiklarna med ultrarent vatten.
- Upprepa sköljning/ultracentrifugering 3x.
- Doppa behållaren med mikropartiklarna i ett isbad före ultraljudshomogeniseringen.
- Homogenisera mikropartiklarna ultraljudsmässigt i två cykler på 4 minuter vardera med en intensitet av 96 % i en ultraljudshomogenisator.
- Kyl behållarna i 1 minut efter den första cykeln.
- Frystorka mikropartiklarna vid en temperatur på -64 °C i en frystork och förvara dem i en exicator för vidare användning.
3. Syntes av naturliga flavonoidinkapslade lignin mikro-/submikronpartiklar
- Upprepa steg 1.1-1.5 för mikropartiklarna.
- Väg upp 0,08 g morin, lös upp det i 1 ml EtOH och tillsätt denna etanollösning till blandningen.
- Rör om blandningen på en magnetomrörare vid 500 rpm i 20 minuter.
- Tillsätt 20 ml 2 N HNO3 droppvis med en spruta med en flödeshastighet på cirka 150 μL/s till blandningen.
- Fortsätt röra om i blandningen i 60 min.
- Upprepa steg 1.8-1.13.
- Upprepa steg 2.1 för submikronpartiklarna.
- Vikt 0,04 g quercetin, lös upp det i 1 ml EtOH och tillsätt denna etanollösning till den alkaliska ligninvattenlösningen.
- Rör om blandningen på en magnetomrörare med 500 rpm i 10 minuter.
- Upprepa steg 2.4-2.13.
4. Bestämning av inkapslingseffektiviteten hos lignin mikro-/sumikropartiklar
- Beräkna innehållet av det tillsatta bioaktiva ämnet under proceduren för syntes av båda typerna av flavonoidinkapslade ligninpartiklar.
- Bestäm spektrofotometriskt absorptionen av flavonoiden i supernatanten som erhölls under steg 1.9 och 2.8 efter spädning med 96 % EtOH.
- Beräkna koncentrationen av det icke-instängda morin/quercetin med hjälp av kalibreringskurvorna för flavonoiderna.
- Beräkna ligninmikropartiklarnas inkapslingseffektivitet (EE, %) i förhållande till de naturliga flavonoiderna med hjälp av ekvation (1):
Nej (1)
därw o är den totala mängden tillsatt bioaktivt ämne (mg) och wf är mängden av den fria, icke fångade flavonoiden (mg). - Beräkna läkemedelsladdningskapaciteten (DLC, %) - en viktig parameter som representerar mängden läkemedel i partiklarna per viktenhet i bärarsystemet - genom att använda ekv. (2):
Nej (2)
där wp är den totala mängden (utbytet) av mikro-/submikronpartiklar av lignin som erhålls efter frystorkning (mg).
Nej (1)
Nej (2)5. Karakterisering av lignin mikro- och submikronpartiklar
- Bestämning av partikelantal, storlek och storleksfördelning
- Bedöm partikelstorleken och partikelstorleksfördelningen för proverna med hjälp av en automatisk cellräknare med möjlighet till pärlantal. Tillsätt med en mikropipett 1 μL av lignin/flavonoid mikro-/submikronpartikelsuspension i ultrarent vatten i brunnen på räkneglaset som krävs för operationen.
- Vänta tills antalet partiklar i 1 ml av suspensionen, liksom deras antal och fördelning efter storlek visas i displayen på den automatiska cellräknaren.
OBS: Apparaten tillåter lagring av data på ett USB-minne. Den automatiska cellräknaren möjliggör vidare bearbetning av de sparade digitala filerna och fotofilerna.
- Bestämning av halten av ytsura/basiska grupper av ligninpartiklar genom potentiometrisk titrering
- Vikt 0,04 g oladdade/flavonoidinkapslade ligninpartiklar.
- Överför dem till en Erlenmeyerkolv, tillsätt 10 ml 0,1 M HCl och placera kolven på en magnetomrörare vid 250 rpm.
- Fyll en 50 ml byrett med en 0,1 M standardlösning av titranten NaOH.
- Mät lösningens initiala pH-värde i Erlenmeyerkolven med en pH-mätare i provbänk innan titreringen påbörjas.
- Starta titreringen och mät pH-värdet för den analyserade lösningen efter varje 0,5 ml tillsatt del av titreren.
- Lagra experimentella data i en tabell som innehåller volymen av den applicerade titranten och motsvarande pH-värde.
- Stoppa titreringen när ett ungefärligt konstant pH-värde uppnås genom att öka volymen på titrantlösningen.
- Plotta experimentella data i form av noll-, första- och andraderivatans differentialtitreringskurvor.
- Bestäm de ekvivalenta punkterna och motsvarande ekvivalenta volymerna för de använda titrarna.
- Beräkna innehållet av de sura basgrupperna Aaoch Abpå ytan av obelastade och flavonoidladdade ligninpartiklar med hjälp av ekvationerna (3) och (4):
, mgeq/g (3)
MGEQ/G (4)
där Veqi är den ekvivalenta volymen (ml); NT titrarensens normalitet (mgeqv/ml); VT Volymen av den titrering som används för bestämningsförfarandet (ml). m Vikten av det analyserade provet (g).
- Bestämning av pH-punkten för nollladdning (pHPZC) för ligninbaserade partiklar med metoden för tillsats av fast ämne.
- Bered 60 ml 0,1 M vattenlösning av NaCl.
- Tillsätt 9 ml 0,1 M NaCl-lösning i var och en av de fem förslutna E-kolvarna och justera pH-värdet till pHi = 2, 4, 7, 10 och 12 (där i = 1–5 anger numret på motsvarande lösning) genom att tillsätta antingen 0,1 M HCl respektive 0,1 M NaOH. Justera den totala volymen av lösningen i varje kolv till 10 ml exakt genom att tillsätta NaCl-lösning med samma styrka.
- Tillsätt 40 mg torra ligninpartiklar (otillsatt, flavonoidbelastade mikro-/submikron) till varje kolv och täck flaskorna ordentligt.
- Fäst kolvarna upprätt på en orbital shaker och låt dem skaka i 24 timmar.
- Låt jämvikten stiga i 30 minuter och mät därefter det slutliga pH-värdet (pHf) för supernatanterna i varje kolv.
- Plotta pHf-värdena mot motsvarande initiala pH-värden (pHi).
- Nollladdningspunkten (pHPZC) definieras som det pH-värde vid vilket kurvan ΔpHkontra pH i skär den räta linjen med koordinaterna (pHi; pHi).
- Bestämning av totalt fenolinnehåll (TPC) i ligninpartiklar
OBS: Den totala fenolhalten (TPC) i mikro-/submikronligninpartiklarna bestäms med en modifierad Folin-Ciocalteu kolorimetrisk metod.- Blanda 200 μl vattensuspension av partiklar med en koncentration på 500 μg/ml med 600 μl ultrarent vatten och 200 μl Folin-Ciocalteu-reagens (1:1, v/v).
- Efter 5 minuter tillsätter du 1,0 ml 8 % Na2CO3 och 1,0 ml Milli-Q vatten till blandningen och inkuberar den i mörker vid 40 °C i 30 minuter i ett vattenbad med intermittent omrörning.
- Centrifugera suspensionen vid 5 300 × g i 2 minuter.
- Förbered ett ämne som inte innehåller några partiklar.
- Överför 3,5 ml av supernatanten i en 10 mm kvartskyvett och mät absorbansen på en UV/Vis-spektrofotometer i det synliga området vid 760 nm mot blindprovet.
- Bered en kalibreringskurva för standardgallussyra enligt steg 5.3.1-5.3.5; Använd endast i stället för 200 μL av ligninpartikelsuspensionen etanollösning av gallussyra med initiala koncentrationer på 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 och 200 μg/ml.
- Uttryck experimentella data för mikropartiklarna som mg gallussyraekvivalenter i milligram per gram torrt prov (mg GAE/g).
- Beräkna TPC med ekvation (5):
mg GAE/g (5)
där CGA är den koncentration i provet som motsvarar koncentrationen av standardgallussyra erhållen från syrans kalibreringskurva (μg GA/ml), Cs är provets koncentration, som är lika med den torra provmassan dividerad med lösningsmedlets volym (μg/ml).
, mgeq/g (3)
MGEQ/G (4)
mg GAE/g (5)6. Bestämning av ligninpartiklars frisättningsförmåga in vitro
- Bered 250 ml simulerat enzymfritt magmedium genom att justera pH-värdet för standardlösning av PBS med 0,1 M HCl till pH = 1,2.
- Bered 250 ml av var och en av de två simulerade tarmvätskelösningarna genom att justera pH-värdet för standardlösningen PBS med 0,1 M NaOH/0,1 M HCl till pH = 6,8 respektive 7,4.
- Tillsätt 25 mg flavonoidinkapslade mikro-/submikronpartiklar till 50 ml av det simulerade enzymfria magmediet i en satsvis glasreaktor försedd med en mekanisk omrörare och placera den i ett termiskt vattenbad vid en konstant temperatur på T = 37 ± 0,2 °C.
- Doppa omröraren till ett djup av 2/3 av vätskevolymen för att säkerställa fullständig blandning av de fasta och flytande faserna och säkerställa maximal massöverföring utan stillastående zoner.
- Ta ut 1 ml prov från reaktorn var 10:e minut upp till 90:e minuten och pipettera omedelbart 1 ml färsk simulerad vätskelösning in i reaktorn för att förhindra förändring av den totala volymen och för att säkerställa sänkförhållandena.
- Upprepa samma procedur inklusive steg 6.3-6.6 med båda simulerade tarmvätskelösningarna med pH = 6,8 respektive 7,4 i 200 min.
- Utföra analoga experiment med obelastade ligninpartiklar i de tre simulerade medierna och använda proverna som blankprover för nollställning av spektrofotometern.
- Bestäm absorptionen av proverna spektrofotometriskt efter filtrering av proverna och spädning av dem med 96 % EtOH mot blankproverna från steg 6.7 och beräkna motsvarande flavonoidkoncentration med hjälp av motsvarande kalibreringskurvor för morin erhållna vid pH = 1,2, 6,8 respektive 7,4.
- Beräkna den kumulativa frisättningen (CR) av bioflavonoiderna med hjälp av ekvation (6) i μg/ml och den kumulativa frisättningsprocenten (CRP) med ekvation (7):
(6)
där Ci och Ci + 1 är koncentrationerna av morin/quercetin i det i:te och (i+1) provet (μg/ml), Vs Den provvolym som tas från satsreaktorn (ml). V Den totala volymen av det simulerade mediet (ml).
Nej (7)
där Cmax är den maximala koncentrationen av den biologiskt aktiva föreningen i bäraren (μg/ml).
(6)
Nej (7)7. Statistiska analyser
- Uttryck experimentella data som medelvärden ± standardavvikelser (SD) för tre oberoende mätningar.
- Bestäm den statistiska signifikansen av de experimentella resultaten genom att utföra ANOVA-testet som post hoc-test. Betrakta ett värde på p < 0,05 statistiskt signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En utfällningsteknik mot lösningsmedel utfördes för att producera alkaliska lignin mikro-/submikronpartiklar. En vattenlösning av utspädd oorganisk syra-salpetersyra/organisk syra-citronsyra dispergerades i en alkalisk ligninvattenlösning, berikad med ett miljövänligt ytaktivt ämne/etanol, vilket resulterade i en gradvis utfällning av biopolymeren löst ämne och, efter ultraljudsbehandling, en suspension av kompakta mikro-/submikronpartiklar producerades slutligen (Figur 1).
Figur 1: Homogenisering av ligninpartiklar. (A) Ultraljudshomogenisering av de syntetiserade ligninsubmikronpartiklarna; (B) Homogeniserade morinladdade och oladdade ligninmikropartiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Storleken, antalet och storleksfördelningen av de obelastade och morininkapslade ligninmikrobärarna bestämdes (Figur 2). Experimentella data visade högre koncentration, 1 × 107 partiklar/ml (2 037 partiklar/μL), och högre genomsnittlig storlek, 6,1 μm, av de bioflavonoidladdade mikrobärarna (figur 2B) än de obelastade med en koncentration på 7,4 × 106 partiklar/ml (1 474 partiklar/μL) och en genomsnittlig storlek på 5,7 μm (figur 2A). Den procentuella storleksfördelningen för båda typerna av partiklar inom storleksintervallet 3-6 μm var 75,2 % för de obelastade och 69,3 % för de morinkapslade mikrobärarna och 20,2 % respektive 25,2 % inom intervallet 7-10 μm. Mängden, koncentrationen och flödeshastigheten av antilösningsmedlet, salpetersyra, är avgörande för partiklarnas storlek. Den högre koncentrationen och större mängden syra leder till större partiklar, medan den högre flödeshastigheten framkallar aggregering av suspensionen.
Figur 2: Partikelstorleksfördelning. (A) Faktisk storleksfördelning av oladdade ligninmikropartiklar i 1 μl suspensionsprogramvara i partikelräknaren. (B) Faktisk storleksfördelning av morinkapslade alkaliligninmikropartiklar i 1 μl suspensionsprogramvara i partikelräknaren. C) Partikelräknare, mikroskopiskt foto av fördelningen av de oladdade ligninmikropartiklarna. D) Partikelräknare, mikroskopiskt foto av fördelningen av de morinkapslade alkaliska ligninmikropartiklarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 visar UV/Vis-absorptionsspektra för etanolmorinlösningar, vattenlösningar av alkalilignin och blandningar som innehåller morin och lignin med olika initiala koncentrationer. Det är uppenbart att absorptionstopparna för rent lignin och bioflavonoid inte sammanfaller och heteropolymeren utövar ingen störande inverkan under den tillämpade spektrofotometriska metoden för bestämning av morinkoncentrationen i vätskefasen efter inkapsling av flavonoiden i polymermikrobärarna och under in vitro-frisättningsexperimenten. Den maximala absorptionen av morin i tvåkomponentblandningen skiftade till en högre våglängd, från λmax = 359 nm till λmax = 395 nm, som ett resultat av mediets ökade pH på grund av närvaron av alkalilignin. Den senare avvikelsen av absorptionsmaximum i det synliga området provocerade fram nödvändigheten av att konstruera kalibreringskurvor för morin vid olika pH-värden i mediet (Figur 4A). De tre standardkurvorna som kännetecknas av mycket starka linjära korrelationer bevisades av de höga värdena på regressionskoefficienterna (R2 > 0,99) inom morinkoncentrationsområdet Co = 2,5-100 μg/ml. På samma sätt visade de tre standardkurvorna för quercetin i de tre simulerade fysiologiska avdelningarna, som presenteras i figur 4B, hög linjäritet inom samma koncentrationsintervall.
Figur 3: Jämförelse av UV/Vis-spektra för etanollösningar av morin, vattenlösningar av alkalilignin och blandningar som innehåller morin och lignin med olika initiala koncentrationer. Spektra av rent lignin och morin sammanfaller inte och heteropolymeren utövar ingen störande påverkan. Tillsatsen av lignin till morin leder till en förskjutning av den maximala absorptionen av morin till en högre våglängd, från λmax = 359 nm till λmax = 395 nm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kalibreringskurvor för etanolflavonoidlösningar. (A) Morin och (B) quercetin inom koncentrationsintervallet Co = 2,5-100 μg/ml vid pH = 1,2 (i blått) (motsvarande simulerad magvätska), pH = 6,8 (i rött) (motsvarande simulerad tunntarmsvätska) och pH = 7,4 (i grönt) (motsvarande simulerad kolonvätska). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Den relativa koncentrationen av sura och basiska aktiva platser/funktionella grupper på ytan av de obelastade och laddade alkaliligninpartiklarna bestämdes genom potentiometrisk titrering. Beräkningarna baserades på de ekvivalenta titreringsvolymerna som bestämdes av andraderivatans differentialtitreringskurvor (figur 5). Värdena för det fastställda pKa, koncentrationerna av sura (starka, svaga, totala) funktionella grupper samt pH och pHpzc för mikro- och submikronpartiklarna presenteras i tabell 1.
Figur 5: Andra derivatans differentiella potentiometriska titreringskurvor för de oladdade och laddade ligninmikro-/submikronpartiklarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Parameter | Mikropartiklar av lignin | Morininkapslade ligninmikropartiklar | Lignin submikrona partiklar | Quercetin-inkapslade lignin submikronpartiklar |
| Veq., ml | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (stark), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (svag), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (totalt), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (vattenhaltig suspension) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pHpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
Tabell 1: Värden för den ekvivalenta volymen av titrering (Veq), den negativa basen -10 logaritmen av den sura dissociationskonstanten (pKa), koncentrationer av sura (starka, svaga, totala) funktionella grupper (Aa, mgeq/g), pH och nollladdningspunkt (pHpzc) för de obelastade och laddade ligninmikro- och submikronpartiklarna. De mikro- och submikroniska, obelastade och flavonoidladdade ligninpartiklarna är negativt laddade eftersom deras pH >pH pzc.
Den totala fenolhalten (TPC), bestämd med en modifierad kolorimetrisk metod från Folin-Ciocalteu och beräknad som gallussyraekvivalenter, var 78,2 mg GAE/g av de obelastade ligninpartiklarna, medan värdet av TPC för de morinkapslade mikrobärarna med samma koncentration var 2,3 gånger högre (183,43 mg GAE/g). Det senare indikerar att heterobiopolymerpartiklarna är berikade med ytterligare fenolgrupper på grund av inkorporeringen av flavonoidmolekylerna. Den flavonoida inkapslingseffektiviteten var: 98,1 % för morin och 97,6 % för quercetin. Läkemedelsinkapslingskapaciteten var 28,2 % för de morinladdade mikropartiklarna och 39,0 % för de quercetinkapslade submikronpartiklarna.
Den kumulativa frisättningen av morin och quercetin in vitro undersöktes i simulerade gastrointestinala enzymfria medier: mag-, tunntarms- och tjocktarmsvätskor vid pH = 1,2, 6,8 respektive 7,4 (Figur 6). Den högsta frisättningseffektiviteten på cirka 24 % uppnåddes efter 30-40 minuter vid pH = 6,8. Enligt de experimentella resultaten var mängden frisatt flavonoid i det simulerade tunntarmsmediet dubbelt så stor som den som frisattes i den simulerade tjocktarmsmiljön och tre gånger den frisättningseffektivitet som bestämdes i magsäcken. Den högsta omfattningen av quercetinfrisättning som fastställts i SIF vid pH = 7,4 den 70:e-90:e minuten var 34 %, vilket överträffade den kumulativa frisättningen av flavonoiden i SGF (pH = 1,2) och SIF (pH = 6,8) vid 23,5 % och 18 %, respektfullt.
Figur 6: Jämförande analyser av den kumulativa in vitro-frisättningseffektiviteten av morin och quercetin från ligninmikro- och submikronpartiklar i simulerade fysiologiska medier. Den högsta graden av morinfrisättning uppnåddes i simulerat tunntarmsmedium. Den högsta frisättningseffektiviteten av quercetin registrerades i simulerad kolonvätska. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bland de viktigaste kritiska frågorna för moderna syntesmetoder för design av läkemedelsbärarformuleringar baserade på biopolymerer är tillämpningen av farliga organiska reagenser - flyktiga och brandfarliga lösningsmedel, såsom tetrahydrofuran, aceton, metanol och till och med DMSO i höga koncentrationer - vilket begränsar deras tillämplighet inom biomedicin, läkemedelsindustri och livsmedelsteknik på grund av manifestationen av möjliga toxiska effekter20, 21,22,23,24. En annan avgörande punkt är involveringen av komplicerade kemiska reaktioner (t.ex. förestring, polymerisation) eller dyr apparatur under syntesproceduren. Båda teknikerna som presenteras i det aktuella manuskriptet övervinner de senare begränsningarna genom att använda alternativa lösningsmedel (vatten) och icke-toxiska föreningar som ytaktiva ämnen (Tween 80) och tvärbindningsmedel (etanol, citronsyra), vilket klassificerar dem som "gröna" syntesmetoder. Dessutom erbjuder metoderna en lösning som uppfyller den kritiska nödvändigheten och behovet av att utveckla billiga, miljövänliga, hållbara procedurer för design av ligninpartiklar, som fungerar som biologiskt nedbrytbara, bioaktiva och biokompatibla bärarmallar för fysiologiskt aktiva substanser25.
För att erhålla ligninpartiklar med önskad storlek valdes två produktionsbetingelser: en med hög ligninkoncentration (50 g/L) och salpetersyra som antilösningsmedel och en annan med lägre ligninkoncentration (5 g/L), etanol som antilösningsmedel och citronsyra som spelar en dubbel roll som antilösningsmedel och tvärbindningsmedel samtidigt, eftersom dessa var de två variablerna som påverkade storleken på ligninpartiklar. Flödeshastigheten under båda procedurerna hölls låg för att ge mindre partiklar och för att förhindra att de aggregering. Det finns några kritiska punkter som måste beaktas när det gäller valet av oorganiska och organiska syror för syntesprotokollen.
Salpetersyra valdes eftersom det är en stark oorganisk syra, som ger en hög grad av utfällning av alkalilignin, och genom att kontrollera hastigheten på dess tillsats kan partiklar inom det önskade storleksintervallet erhållas. Dessutom förväntas det att tillsatsen av HNO3 kan ge modifiering av heteropolymerpartiklarna på grund av troliga kemiska förändringar av ligninstrukturen i samband med: processer för nitreringssubstitutionsreaktioner av H-atomer i bensenringarna med -NO2-grupper ; förestring av alifatiska-OH-grupper och bildning av esterfunktionella grupper; och/eller oxidation av grupperna fenol-OH och -OCH-OCH 3 , vilket resulterar i bildandet av kinonstrukturer. När det gäller precipitantens och ligninkoncentrationens roll för storleken på de syntetiserade partiklarna ledde å ena sidan den högre initiala ligninkoncentrationen i kombination med tillsatsen av den starka salpetersyran (pKa = -1,4) och den begränsade lösligheten av den alkaliska heteropolymeren i den oorganiska syran till produktion av partiklar inom mikrometerområdet. Å andra sidan provocerar tillsatsen av etanol till den vattenhaltiga lösningen av alkalilignin med den lägre koncentrationen bildandet av en fin suspension på grund av den partiella lösligheten av alkalilignin i alkoholen. Dessutom ledde den efterföljande tillsatsen av citronsyra till produktion av partiklar inom nanometerområdet eftersom den organiska syran är svagare (pKa1 = 3,13) än salpetersyra, vilket ger lägre utfällningsutsträckning.
Några grundläggande egenskaper hos läkemedel i nanostorlek är läkemedelscirkulation, frisättning av läkemedel från doseringsformer på specifika platser och absorption genom biologiska membran. Dessa egenskaper påverkas i hög grad av vissa fysikaliska och kemiska egenskaper hos nanopartikelbärarna och av de inkapslade läkemedelsmolekylerna.
De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos bärare av biopolymerer: koncentration av ytaktiva sura och basiska grupper, punkt med noll laddning (pHPZC), storlek, partikelstorleksfördelning, samt partiklarnas spektrala egenskaper före och efter inkorporeringen av det bioaktiva ämnet, är väsentliga parametrar som måste beaktas vid utvärdering av de funktionella grupperna, reaktivitet, Partiklarnas stabilitet och homogenitet10.
Partikelstorlek, partikelstorleksfördelning, laddning och morfologi är bland de viktigaste faktorerna som påverkar dessa utvärderingar. Partikelstorleken påverkar deras stabilitet, reaktivitet och frisättningsbeteende26. Mindre partiklar erbjuder en större massöverföringsyta, vilket leder till en högre frisättningshastighet för läkemedel. Däremot resulterar den mindre massöverföringsytan hos större partiklar i en lägre hastighet av läkemedelsdiffusion inuti dessa partiklar.
Tillämpningen av titrimetriska metoder som grundläggande tekniker för bestämning av sura och basiska platser och funktionella grupper som finns på fasta ytor expanderar ständigt. De främsta fördelarna med potentiometrisk titrering inkluderar tids- och arbetsbesparing, hög precision och eliminering av referensstandarder och dyr apparatur. Metoden tillämpades i den aktuella studien eftersom den möjliggör karakterisering av biopolymerpartiklar genom kvalitativ och semikvantitativ bestämning av karaktären och antalet aktiva platser som finns på ytan av laddade och obelastade biopolymerbärare27.
Ytladdningen hos biologiska och medicinska mikro-/nanobärare spelar en viktig roll i cellulärt upptag28. pHPZC motsvarar noll ytladdningsdensitet, det vill säga ekvivalenta mängder negativa och positiva laddningar som utvecklas av protonjämvikter. Bestämningen av dessa värden ger information om specificiteten för adsorption29. Men eftersom parametern isoelektrisk punkt endast representerar de yttre ytladdningarna av partiklar i suspension, medan punkten för noll laddning varierar som svar på den totala nettoytladdningen (extern och intern) av partiklarna, tillämpades pHpzc-protokollet för första gången i den aktuella studien som en enkel och effektiv metod för karakterisering av biopolymera läkemedelsbärare. Enligt begreppet pHpzc, vid pH över pHpzc, är ytan på biopolymerpartiklarna övervägande negativt laddad, medan en positiv nettoladdning observeras när suspensionens pH är under pHpzc. Från de experimentella data som presenteras i tabell 1 kan man dra slutsatsen att mikro- och submikron, obelastade och flavonoidladdade ligninpartiklar är negativt laddade eftersom deras pH >pH pzc.
Effektiviteten av flavonoidbelastning påverkas av inkapslingseffektiviteten och läkemedelsladdningskapaciteten. Inkapslingseffektivitet (E, %) definieras som förhållandet mellan mängden av läkemedlet som ingår i partiklarna och den totala mängden i formuleringen. Inkapslingseffektiviteten påverkas av läkemedlets egenskaper, lösningsmedlet och bäraren30.
Den effektiva tillförseln av en fysiologiskt aktiv substans beror dock på hur och i vilken utsträckning dess molekyler frigörs från bärarmatrisen. Därför är det mycket viktigt att ta hänsyn till läkemedelsfrisättningsmekanismen och frisättningshastigheten 31,32,33. Genom att belysa in vitro-frisättningsmekanismen hos bioflavonoider från deras biopolymera mikro-/nanobärare kan man simulera och förutsäga beteendet hos flavonoiden och bäraren i ett verkligt fysiologiskt medium och optimera utformningen av farmaceutiska formuleringar med förbättrad biotillgänglighet. De experimentella in vitro-resultaten som erhållits i denna studie är användbara för klinisk praxis eftersom de bevisar att på grund av den lägre graden av morin/quercetinfrisättning från ligninsubmikron och mikropartiklar i magmiljön, är de innovativa biopolymerpartiklarna lämpliga för oral administrering på grund av den lägre risken för magirritation jämfört med direkt oral administrering av de bioaktiva substanserna. De innovativa mikropartiklarna av biopolymer är lämpliga för oral administrering på grund av den lägre risken för magirritation jämfört med direkt oral administrering av de bioaktiva substanserna. Dessutom kan de submikrona partiklarna, på grund av deras ringa storlek och betydande frisättningspotential, användas som injicerbara formuleringar. Dessutom erbjuder de nya ligninmikro- och submikronbärarna en möjlighet att övervinna de begränsningar som rapporterats av andra forskare relaterade till svårigheter förknippade med oral administrering av höga doser av vissa bioflavonoider, till följd av deras tendens att bilda mättade lösningar i tarmkanalen, vilket i sin tur hindrar upplösningsprocessen och deras effektiva resorption.
Lättheten att syntetisera, biokompatibiliteten hos de resulterande partiklarna, liksom möjligheten att anpassa det nuvarande protokollet, representerar de stora fördelarna med den presenterade metodiken. Partiklarnas storlek är optimal för deras avsedda tillämpningar, vilket ger tillräckligt med yta för att fästa terapeutiska ämnen och rikta in sig på fraktioner, vilket i sin tur inte kräver att fler partiklar administreras för att uppnå måldoseringskraven. Användningen av lignin som den grundläggande heteropolymermatrisen för syntes av innovativa partiklar möjliggör ökad biokompatibilitet och erbjuder olika aktiva funktionella grupper, vilket ger möjligheter till anpassning av partiklarna för olika applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att uppge.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av den bulgariska vetenskapliga fonden enligt kontrakt nr KΠ-06 H59/3 och av vetenskapligt projekt nr 07/2023 FVM, Trakia University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
References
- Yu, X., et al. Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics. ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).
- Boarino, A., Klok, H. -A. Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications. Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).
- Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging. Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).
- Sharma, S., et al. Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application. Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041 (2022).
- Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T.
- Beaucamp, A., et al. Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review). Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).
- Antunes, F., et al. From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application. Int J Biol Macromol. 234, 123592 (2023).
- Garg, J., et al. Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update. Materials Letters. 311, 131573 (2022).
- Anushikha, K. K. Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications. Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).
- Freitas, F. M. C., et al. synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment. Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).
- Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus. Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070 (2020).
- Worku, L. A., et al. Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application. Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793 (2023).
- Gala Morena, A., Tzanov, T. z Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials. Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).
- Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative. Int J Mol Sci. 24 (16), 12705 (2023).
- Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity. Pharmaceutics. 15 (4), 1067 (2023).
- Yaneva, Z., et al. Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity. Antibiotics. 11, 650 (2022).
- Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications. Polymers. 15 (6), 1487 (2023).
- Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).
- Tang, Q., et al. Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications. Polymers. 12 (11), Basel. 2471 (2020).
- Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin. Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).
- Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate. Food Res Int. 66, 93-99 (2014).
- Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. Lignin from micro- to nanosize: Applications. Int. J. Mol. Sci. 18, 2367 (2017).
- Mishra, P. K., Ekielski, A. A simple method to synthesize lignin nanoparticles. Colloids Interfaces. 3, 52 (2019).
- Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor. Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).
- Tardy, B. L., et al. Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules. Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).
- Silva, M., et al. Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies. J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).
- Georgieva, N., Yaneva, Z. Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study. Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).
- Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. Charge reversal nano-systems for tumor therapy. J Nanobiotechnol. 20, 31 (2022).
- Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).
- Zatorska, M., et al. Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study. Int J Pharmaceutics. 591, 120031 (2020).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).
- Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass. Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).
