Summary
Wir beschreiben neuartige, einfache Methoden der Synthese und Charakterisierung von biokompatiblen Lignin-Mikro- und Submikron-Partikeln. Diese Formulierungen bieten einen einfachen Ansatz für die Nutzung des Heteropolymers sowie eine Alternative für das rationale Design multifunktionaler Trägermatrizen mit potenzieller Anwendbarkeit in der Biomedizin, Pharmatechnik und Lebensmittelindustrie.
Abstract
Die Anwendbarkeit der Biopolymer-Mikro-/Nanotechnologie in der Human-, Veterinär-, Pharma- und Lebensmitteltechnik wächst aufgrund des großen Potenzials von biopolymerbasierten Partikeln als effektive Trägersysteme rasant. Die Verwendung von Lignin als basische Heteropolymer-Biomatrix für das Design innovativer Mikro-/Submikron-Formulierungen ermöglicht die Erzielung einer erhöhten Biokompatibilität und bietet verschiedene aktive funktionelle Gruppen, die Möglichkeiten zur Anpassung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und Bioaktivitäten der Formulierungen für verschiedene Anwendungen bieten. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, eine einfache und umweltfreundliche Methodik für die Synthese von Ligninpartikeln mit Mikro- und Submikrongröße zu entwickeln; ihre physikalisch-chemischen, spektralen und strukturellen Eigenschaften zu bewerten; und ihre Fähigkeit zur Verkapselung biologisch aktiver Moleküle und ihr Potenzial für die In-vitro-Freisetzung von Bioflavonoiden in simulierten gastrointestinalen Medien zu untersuchen. Die vorgestellten Methoden verwenden billige und umweltfreundliche Lösungsmittel; Einfache, unkomplizierte, schnelle und empfindliche Prozesse, die wenig Ausrüstung, ungiftige Substanzen und einfache Methoden für ihre Charakterisierung, die Bestimmung des Verkapselungsvermögens gegenüber den schwer wasserlöslichen bioaktiven Verbindungen Morin und Quercetin und das In-vitro-Freisetzungspotenzial der Ligninmatrizen erfordern.
Introduction
Heutzutage hat die Neigung zu Biopolymeren wie Cellulose, Chitosan, Kollagen, Dextran, Gelatine und Lignin als Vorläufer für das Design von Mikro-/Submikron-Trägern mit anpassbarer Größe, physikalisch-chemischen Eigenschaften und Biofunktionalitäten in der biomedizinischen, pharmazeutischen und lebensmitteltechnischen Industrie aufgrund ihrer Anwendbarkeit im Tissue Engineering, 3D-Bioprinting und in vitro zugenommen Krankheitsmodellierungsplattformen, Verpackungsindustrie, Emulsionszubereitung und Nährstoffabgabeunter anderem 1,2,3.
Neuartige Studien beleuchten die Aspekte von ligninbasierten Hydrogelen sowie Mikro- und Nanoformulierungen4 als vorteilhafte Vehikel für Lebensmittelverpackungsmaterialien5, Energiespeicherung6, Kosmetika7, Wärme-/Lichtstabilisatoren, verstärkte Materialien und Wirkstoffträgermatrizen8 für die Abgabe hydrophober Moleküle, Verbesserung von UV-Barrieren9, als Verstärkungsmittel in Nanokompositen und als Alternative zu anorganischen Nanopartikeln aufgrund einiger aktueller Sicherheitsprobleme 10,11,12. Der Grund für diese Tendenz ist die Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit und Nicht-Toxizität des natürlichen Hetero-Biopolymers sowie seine nachgewiesenen Bioaktivitäten in Bezug auf Lignin-antioxidatives Potenzial und Radikalfänger, antiproliferative und antimikrobielle Aktivitäten 13,14,15,16,17.
In der wissenschaftlichen Literatur werden verschiedene Methoden zur Synthese (Selbstorganisation, Anti-Lösungsmittelfällung, Säurefällung und Lösungsmittelverschiebung)18 und zur Charakterisierung von Lignin-basierten mikro-/nanoskaligen Formulierungen berichtet, einschließlich der Anwendung teurer oder schädlicher Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO), N,N-Dimethylformamid (DMF) und Aceton sowie komplizierter, indirekter und langwieriger Prozesse, bei denen viele Geräte und giftige Substanzen verwendetwerden 12,19,20.
Um die letztgenannten Nachteile zu überwinden, stellen die folgenden Protokolle neuartige Methoden für die Synthese von Lignin-basierten Mikro-/Submikron-Partikeln unter Verwendung billiger und umweltfreundlicher Lösungsmittel vor: Einfache, unkomplizierte, schnelle und empfindliche Prozesse, die wenig Ausrüstung, ungiftige Substanzen und einfache Methoden zu ihrer Charakterisierung und zur Bestimmung der Verkapselungskapazität für schwer wasserlösliche bioaktive Verbindungen und des In-vitro-Freisetzungspotenzials der Ligninmatrizen erfordern. Die vorgestellten Produktionsmethoden im Labormaßstab sind vorteilhaft für die Herstellung von funktionellen Ligninträgern mit einstellbaren Größen, hoher Verkapselungskapazität und nachhaltigem In-vitro-Freisetzungsverhalten unter Verwendung einfacher Charakterisierungsverfahren und umweltfreundlicher Chemikalien, die in verschiedenen Bereichen der biomedizinischen Wissenschaften und Lebensmitteltechnologie Anwendung finden können. Zwei Flavonoide wurden als Zielmoleküle in die Ligninpartikel eingekapselt: Morin in die Mikropartikel und Quercetin in die Submikronpartikel. Der Unterschied in den Strukturen beider Flavonoide ist nur die Position der zweiten -OH-Gruppe im B-aromatischen Ring: Die -OH-Gruppe befindet sich auf der 2'-Position in Morin und auf der 3'-Position in Quercetin, somit sind beide organischen Verbindungen Positionsisomere. Letzteres setzt ein ähnliches Verhalten beider bioaktiver Naturstoffe bei den Prozessen der Verkapselung und/oder Freisetzung voraus.
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Protocol
1. Synthese von Lignin-Mikropartikeln
- Bereiten Sie eine wässrige Lösung mit 50 mg/ml Alkali-Lignin vor, indem Sie 2,5 g Alkali-Lignin in 50 ml Reinstwasser auf einem Magnetrührer auflösen.
- Bereiten Sie eine 1%ige Tween 80-Lösung vor, indem Sie 1 mL Tween 80 in 100 mL Reinstwasser auflösen.
- Bereiten Sie eine 2 M Lösung von HNO3 vor, indem Sie 6,65 mL 67 % HNO3 (Dichte = 1,413 g/ml) mit Reinstwasser auf ein Endvolumen von 50 mL verdünnen.
- Geben Sie langsam 15 ml der 1%igen Tween 80-Lösung zu 50 ml der 50 mg/ml-Alkali-Lignin-Lösung.
- Rühren Sie das Gemisch auf einem Magnetrührer bei 500 U/min für 10 Minuten, damit sich das Tensid gut verteilt.
- 20 mL 2 M HNO3 tropfenweise mit einer Spritze bei einer Flussrate von ca. 150 μl/s in die Mischung geben.
- Rühren Sie die Mischung 30 Minuten lang weiter, während sich die dunkelbraune Lösung in eine hellbraune Suspension von Mikropartikeln verwandelt.
- Die Suspension in 1,5-2 mL Reagenzgläser überführen und 30 min bei 15.000 × g in einer Ultrazentrifuge bei 10 °C zentrifugieren.
- Sammeln Sie den Überstand für weitere Analysen und spülen Sie die Mikropartikel mit Reinstwasser ab.
- Wiederholen Sie die Spül-/Ultrazentrifugationsvorgänge 3x.
- Tauchen Sie den Behälter mit den Mikropartikeln vor der Ultraschall-Homogenisierung in ein Eisbad.
- Homogenisieren Sie die Mikropartikel 4 min lang mit einer Intensität von 93 % auf einem Ultraschall-Homogenisator.
- Lyophilisieren Sie die Mikropartikel bei einer Temperatur von -64 °C in einem Gefriertrockner und lagern Sie sie in einem Exikator zur weiteren Verwendung.
2. Synthese von Lignin-Submikron-Partikeln
- Bereiten Sie eine wässrige Lösung mit 5 mg/ml Alkali-Lignin vor, indem Sie 125 mg Alkali-Lignin in 25 ml Reinstwasser auf einem Magnetrührer auflösen.
- Geben Sie langsam 1 ml 96% EtOH in die Alkali-Lignin-Lösung.
- Rühren Sie die Mischung auf einem Magnetrührer bei 500 U/min für 3 min.
- Bereiten Sie 50 ml einer 1%igen Zitronensäurelösung vor, indem Sie 0,5 g Zitronensäure in Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 50 ml auflösen.
- Geben Sie 7 ml 1%ige Zitronensäure tropfenweise mit einer Spritze bei einer Durchflussrate von ca. 4 ml/min in die Mischung.
- Rühren Sie die Mischung 10 Minuten lang weiter, bis sich die braune, klare Lösung in eine trübe, hellbraune Suspension aus Submikronpartikeln verwandelt.
- Die Suspension in Reagenzgläser überführen und 30 min bei 15.000 × g in einer Ultrazentrifuge bei 10 °C zentrifugieren.
- Sammeln Sie den Überstand für weitere Analysen und spülen Sie die Mikropartikel mit Reinstwasser ab.
- Wiederholen Sie die Spül-/Ultrazentrifugationsvorgänge 3x.
- Tauchen Sie den Behälter mit den Mikropartikeln vor der Ultraschall-Homogenisierung in ein Eisbad.
- Homogenisieren Sie die Mikropartikel in zwei Zyklen von je 4 min mit einer Intensität von 96 % in einem Ultraschall-Homogenisator mit Ultraschall.
- Kühlen Sie die Behälter nach dem ersten Zyklus 1 Minute lang ab.
- Lyophilisieren Sie die Mikropartikel bei einer Temperatur von -64 °C in einem Gefriertrockner und lagern Sie sie in einem Exikator zur weiteren Verwendung.
3. Synthese von natürlichen, mit Flavonoiden verkapselten Lignin-Mikro-/Submikron-Partikeln
- Wiederholen Sie die Schritte 1.1-1.5 für die Mikropartikel.
- Wiegen Sie 0,08 g Morin, lösen Sie es in 1 ml EtOH auf und fügen Sie diese ethanolische Lösung zu der Mischung hinzu.
- Rühren Sie die Mischung auf einem Magnetrührer bei 500 U/min für 20 min.
- 20 mL 2 N HNO3 tropfenweise mit einer Spritze bei einer Flussrate von ca. 150 μl/s in die Mischung geben.
- Rühren Sie die Mischung 60 Minuten lang weiter.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.8-1.13.
- Wiederholen Sie Schritt 2.1 für die Submikron-Partikel.
- Wiegen Sie 0,04 g Quercetin, lösen Sie es in 1 mL EtOH und geben Sie diese ethanolische Lösung in die wässrige Alkali-Lignin-Lösung.
- Rühren Sie die Mischung auf einem Magnetrührer bei 500 U/min für 10 min.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.13.
4. Bestimmung der Verkapselungseffizienz von Lignin-Mikro-/Sumikropartikeln
- Berechnen Sie den Gehalt der zugesetzten bioaktiven Substanz während des Verfahrens zur Synthese beider Arten von Flavonoid-verkapselten Ligninpartikeln.
- Die Resorption des Flavonoids in dem in den Schritten 1.9 und 2.8 erhaltenen Überstand wird spektrophotometrisch bestimmt, nachdem es mit 96 % EtOH verdünnt wurde.
- Berechnen Sie die Konzentration des nicht eingeschlossenen Morins/Quercetins anhand der Kalibrierkurven der Flavonoide.
- Berechnen Sie die Verkapselungseffizienz (EE, %) der Lignin-Mikropartikel gegenüber den natürlichen Flavonoiden mit Hilfe von Gleichung (1):
(1)
Dabei ist wo die Gesamtmenge des zugesetzten bioaktiven Stoffes (mg) und wf die Menge des freien, nicht eingeschlossenen Flavonoids (mg). - Berechnen Sie die Wirkstoffladekapazität (DLC, %) - ein wichtiger Parameter, der die Menge des Arzneimittels in den Partikeln pro Gewichtseinheit des Trägersystems darstellt - mit Gl. (2):
(2)
Dabei ist wp die Gesamtmenge (Ausbeute) der nach der Lyophilisation (mg) erhaltenen Lignin-Mikro-/Submikron-Partikel.
(1)
(2)5. Charakterisierung von Lignin-Mikro- und Submikron-Partikeln
- Bestimmung von Partikelanzahl, -größe und -größenverteilung
- Beurteilen Sie die Partikelgröße und die Partikelgrößenverteilung der Proben mit einem automatischen Zellzähler mit der Option für die Raupenzählung. Mit einer Mikropipette 1 μl der Lignin/Flavonoid-Mikro-/Submikron-Partikelsuspension in Reinstwasser in die Vertiefung des für den Vorgang erforderlichen Zählobjektträgers geben.
- Warten Sie, bis die Anzahl der Partikel in 1 ml der Suspension sowie deren Anzahl und Verteilung nach Größe auf dem Display des automatischen Zellzählers angezeigt werden.
HINWEIS: Das Gerät ermöglicht die Speicherung der Daten auf einem USB-Flash. Die spezielle Software für den automatischen Zellzähler ermöglicht die Weiterverarbeitung der gespeicherten Digital- und Fotodateien.
- Bestimmung des Gehalts an sauren/basischen Oberflächengruppen von Ligninpartikeln durch potentiometrische Titration
- Gewicht 0,04 g unbeladene/mit Flavonoiden verkapselte Ligninpartikel.
- Füllen Sie sie in einen Erlenmeyerkolben, fügen Sie 10 mL 0,1 M HCl hinzu und stellen Sie den Kolben auf ein Magnetrührwerk bei 250 U/min.
- Füllen Sie eine 50 mL Bürette mit einer 0,1 M Standardlösung des Titriermittels NaOH.
- Messen Sie den anfänglichen pH-Wert der Lösung im Erlenmeyerkolben mit einem Tisch-pH-Messgerät, bevor Sie mit der Titration beginnen.
- Starten Sie die Titration und messen Sie den pH-Wert der analysierten Lösung nach jeweils 0,5 ml zugegebenem Teil des Titrationsmittels.
- Speichern Sie die Versuchsdaten in einer Tabelle, die das Volumen des aufgetragenen Titriermittels und den entsprechenden pH-Wert enthält.
- Stoppen Sie die Titration, wenn ein annähernd konstanter Wert des pH-Werts erreicht ist, indem Sie das Volumen der Titriermittellösung erhöhen.
- Plotten Sie die experimentellen Daten in Form von differentiellen Titrationskurven mit null, erster und zweiter Ableitung.
- Bestimmen Sie die Äquivalentpunkte und die entsprechenden äquivalenten Volumina der verwendeten Titranten.
- Berechnen Sie die Gehalte der sauren basischen Gruppen Aaund Abauf der Oberfläche von unbeladenen und flavonoidbeladenen Ligninpartikeln mit Hilfe der Gleichungen (3) und (4):
, mGEQ/g (3)
mGEQ/G (4)
Dabei ist Veqi das äquivalente Volumen (ml); NT die Normalität des Titriermittels (mgeqv/mL); VT das Volumen des Titriermittels, das für das Bestimmungsverfahren verwendet wird (ml); m das Gewicht der analysierten Probe (g).
- Bestimmung des pH-Punktes der Nullladung (pH PZC) von Lignin-basierten Partikeln mit der Feststoffadditionsmethode.
- Bereiten Sie 60 mL 0,1 M wässrige Lösung von NaCl vor.
- 9 ml der 0,1 M NaCl-Lösung werden in jeden der fünf verstopften Konuskolben gegeben und der pH-Wert auf pHi = 2, 4, 7, 10 und 12 eingestellt (wobei i = 1-5 die Anzahl der entsprechenden Lösung angibt), jeweils durch Zugabe von 0,1 M HCl oder 0,1 M NaOH. Das Gesamtvolumen der Lösung in jedem Kolben wird durch Zugabe von NaCl-Lösung gleicher Stärke auf 10 ml genau eingestellt.
- Geben Sie 40 mg trockene Ligninpartikel (unbeladene, flavonoidbeladene Mikro-/Submikron) in jeden Kolben und verschließen Sie die Kolben fest.
- Befestigen Sie die Kolben aufrecht auf einem Orbitalschüttler und lassen Sie sie 24 Stunden lang zittern.
- Eine Äquilibrierung wird 30 Minuten lang durchgeführt und anschließend der endgültige pH-Wert (pHf) der Überstände in jedem Kolben gemessen.
- PlottenSie die pH-f-Werte gegen die entsprechenden anfänglichen pH-Werte (pHi).
- Der Ladungsnullpunkt (pHPZC) ist definiert als der pH-Wert, bei dem die Kurve ΔpH gegen pHi die Gerade mit den Koordinaten (pHi; pHi) schneidet.
- Bestimmung des Gesamtphenolgehalts (TPC) von Ligninpartikeln
HINWEIS: Der Gesamtphenolgehalt (TPC) der Mikro-/Submikron-Ligninpartikel wird mit einem modifizierten kolorimetrischen Folin-Ciocalteu-Verfahren bestimmt.- Mischen Sie 200 μl einer wässrigen Suspension von Partikeln mit einer Konzentration von 500 μg/ml mit 600 μl Reinstwasser und 200 μl Folin-Ciocalteu-Reagenz (1:1, v/v).
- Nach 5 min 1,0 mL 8 % Na2CO3 und 1,0 mL Milli-Q Wasser zu der Mischung geben und im Dunkeln bei 40 °C für 30 min in einem Wasserbad unter intermittierendem Rühren inkubieren.
- Die Suspension bei 5.300 × g für 2 min zentrifugieren.
- Bereiten Sie einen Rohling vor, der keine Partikel enthält.
- 3,5 mL des Überstands werden in eine 10 mm Quarzküvette überführt und die Extinktion mit einem UV/Vis-Spektralphotometer im sichtbaren Bereich bei 760 nm gegen den Rohling gemessen.
- Erstellen Sie eine Kalibrierkurve der Standard-Gallussäure gemäß den Schritten 5.3.1-5.3.5; Verwenden Sie anstelle von 200 μl der Ligninpartikelsuspension die ethanolische Lösung von Gallussäure mit Anfangskonzentrationen von 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 und 200 μg/ml.
- Die experimentellen Daten der Mikropartikel sind in mg Gallussäureäquivalente in Milligramm pro Gramm trockener Probe (mg GAE/g) anzugeben.
- Berechnen Sie TPC mit Gleichung (5):
mg GAE/g (5)
Dabei ist CGA die Konzentration der Probe, die der Konzentration der Standardgallussäure entspricht, die aus der Kalibrierfläche der Säure (μg GA/ml) ermittelt wurde; Cs ist die Konzentration der Probe, die gleich der Trockenmasse der Probe dividiert durch das Volumen des Lösungsmittels (μg/ml) ist.
, mGEQ/g (3)
mGEQ/G (4)
mg GAE/g (5)6. Bestimmung des In-vitro-Freisetzungsvermögens von Ligninpartikeln
- Bereiten Sie 250 ml simuliertes enzymfreies Magenmedium vor, indem Sie den pH-Wert der PBS-Standardlösung mit 0,1 M HCl auf pH = 1,2 einstellen.
- Bereiten Sie jeweils 250 ml der beiden simulierten Darmflüssigkeitslösungen vor, indem Sie den pH-Wert der PBS-Standardlösung mit 0,1 M NaOH/0,1 M HCl auf pH = 6,8 bzw. 7,4 einstellen.
- Geben Sie 25 mg flavonoidverkapselte Mikro-/Submikron-Partikel zu 50 mL des simulierten enzymfreien Magenmediums in einen Glasbatch-Reaktor, der mit einem mechanischen Rührer geliefert wird, und legen Sie es in ein Thermalwasserbad bei einer konstanten Temperatur von T = 37 ± 0,2 °C.
- Tauchen Sie das Rührwerk bis zu einer Tiefe von 2/3 des Flüssigkeitsvolumens ein, um eine vollständige Durchmischung der festen und flüssigen Phase zu gewährleisten und einen maximalen Stoffaustausch ohne stagnierende Zonen zu gewährleisten.
- Alle 10 Minuten bis zur 90. Minute wird 1 ml Probe aus dem Reaktor entnommen und sofort 1 ml frische, simulierte flüssige Lösung in den Reaktor pipettiert, um eine Veränderung des Gesamtvolumens zu verhindern und die Senkenbedingungen zu gewährleisten.
- Wiederholen Sie das gleiche Verfahren einschließlich der Schritte 6.3-6.6 mit beiden simulierten Darmflüssigkeitslösungen mit einem pH-Wert = 6,8 bzw. 7,4 für 200 Minuten.
- Führen Sie analoge Experimente mit ungeladenen Ligninpartikeln in den drei simulierten Medien durch und verwenden Sie die Proben als Rohlinge für die Nullstellung des Spektralphotometers.
- Die Absorption der Proben wird spektrophotometrisch bestimmt, nachdem die Proben filtriert und mit 96 % EtOH gegen die Blindproben aus Schritt 6.7 verdünnt wurden, und die entsprechende Flavonoidkonzentration wird unter Verwendung der entsprechenden Kalibrierkurven von Morin berechnet, die bei pH = 1,2, 6,8 bzw. 7,4 erhalten wurden.
- Berechnen Sie die kumulative Freisetzung (CR) der Bioflavonoide anhand von Gleichung (6) in μg/ml und den kumulativen Freisetzungsprozentsatz (CRP) anhand von Gleichung (7):
(6)
Dabei sind Ci und Ci+1 die Konzentrationen von Morin/Quercetin in der i. und (i+1)ten Probe (μg/ml); Vs das Probenvolumen, das dem Batch-Reaktor entnommen wurde (ml); V das Gesamtvolumen des simulierten Mediums (ml).
(7)
Dabei ist Cmax die maximale Konzentration der biologisch aktiven Verbindung im Träger (μg/ml).
(6)
(7)7. Statistische Analysen
- Geben Sie die experimentellen Daten als Mittelwert ± Standardabweichungen (SD) von drei unabhängigen Messungen aus.
- Bestimmen Sie die statistische Signifikanz der Versuchsergebnisse, indem Sie den ANOVA-Test als Post-hoc-Test durchführen. Betrachten Sie einen Wert von p < 0,05 als statistisch signifikant.
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Representative Results
Es wurde eine Anti-Lösungsmittel-Fällungstechnik zur Herstellung von Alkali-Lignin-Mikro-/Submikron-Partikeln durchgeführt. Eine wässrige Lösung aus verdünnter anorganischer Säure-Salpetersäure/organischer Säure-Zitronensäure wurde in eine wässrige Alkali-Lignin-Lösung dispergiert, die mit einem umweltfreundlichen Tensid/Ethanol angereichert war, was zu einer allmählichen Ausfällung des gelösten Biopolymers führte und nach der Beschallung schließlich eine Suspension aus kompakten Mikro-/Submikron-Partikeln hergestellt wurde (Abbildung 1).
Abbildung 1: Homogenisierung von Ligninpartikeln. (A) Ultraschall-Homogenisierung der synthetisierten Lignin-Submikron-Partikel; (B) Homogenisierte morinbeladene und ungeladene Lignin-Mikropartikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Größe, Anzahl und Größenverteilung der unbeladenen und morinverkapselten Lignin-Microcarrier wurden bestimmt (Abbildung 2). Die experimentellen Daten zeigten eine höhere Konzentration von 1 × 107 Partikeln/ml (2.037 Partikel/μl) und eine höhere durchschnittliche Größe von 6,1 μm der mit Bioflavonoiden beladenen Microcarrier (Abbildung 2B) als die unbeladenen mit einer Konzentration von 7,4 × 106 Partikeln/ml (1.474 Partikel/μl) und einer durchschnittlichen Größe von 5,7 μm (Abbildung 2A). Die prozentuale Größenverteilung beider Partikeltypen im Größenbereich von 3-6 μm betrug 75,2 % für die unbeladenen und 69,3 % für die morin-verkapselten Microcarrier und 20,2 % bzw. 25,2 % im Bereich von 7-10 μm. Die Menge, die Konzentration und die Durchflussrate des Lösungsmittels Salpetersäure sind entscheidend für die Größe der Partikel. Die höhere Konzentration und größere Menge der Säure führt zu größeren Partikeln, während die höhere Durchflussrate eine Aggregation der Suspension provoziert.
Abbildung 2: Verteilung der Partikelgröße. (A) Tatsächliche Größenverteilung von ungeladenen Lignin-Mikropartikeln in 1 μl der Suspensionssoftware des Partikelzählers; (B) tatsächliche Größenverteilung von morin-verkapselten Alkali-Lignin-Mikropartikeln in 1 μl der Suspensionssoftware des Partikelzählers. (C) Mikroskopisches Foto des Partikelzählers der Verteilung der ungeladenen Lignin-Mikropartikel; (D) Partikelzählermikroskopisches Foto der Verteilung der morinverkapselten Alkali-Lignin-Mikropartikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 zeigt die UV/Vis-Absorptionsspektren von Ethanol-Morin-Lösungen, alkalischen Lignin-wässrigen Lösungen und den Mischungen, die Morin und Lignin enthalten, mit unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen. Offensichtlich stimmen die Absorptionspeaks von reinem Lignin und dem Bioflavonoid nicht überein und das Heteropolymer übt während des angewandten spektrophotometrischen Verfahrens zur Bestimmung der Morinkonzentration in der flüssigen Phase nach Verkapselung des Flavonoids in die Polymer-Microcarrier und während der in vitro Freisetzungsexperimente keinen störenden Einfluss aus. Die maximale Absorption von Morin in dem Zweikomponentengemisch verschob sich zu einer höheren Wellenlänge von λmax = 359 nm auf λmax = 395 nm, was auf den erhöhten pH-Wert des Mediums aufgrund des Vorhandenseins von Alkalilignin zurückzuführen ist. Die letztgenannte Abweichung des Absorptionsmaximums im sichtbaren Bereich führte zur Notwendigkeit, Kalibrierkurven von Morin bei verschiedenen pH-Werten des Mediums zu entwerfen (Abbildung 4A). Die drei Standardkurven, die durch sehr starke lineare Korrelationen gekennzeichnet sind, wurden durch die hohen Werte der Regressionskoeffizienten (R2 > 0,99) im Morin-Konzentrationsbereich Co = 2,5-100 μg/ml bestätigt. In ähnlicher Weise zeigten die drei Standardkurven von Quercetin in den drei simulierten physiologischen Kompartimenten, die in Abbildung 4B dargestellt sind, eine hohe Linearität innerhalb desselben Konzentrationsbereichs.
Abbildung 3: Vergleich der UV/Vis-Spektren von ethanolischen Lösungen von Morin, wässrigen Alkaliligninlösungen und Gemischen, die Morin und Lignin enthalten, mit unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen. Die Spektren von reinem Lignin und Morin stimmen nicht überein und das Heteropolymer übt keinen störenden Einfluss aus. Die Zugabe von Lignin zu Morin führt zu einer Verschiebung der maximalen Absorption von Morin in eine höhere Wellenlänge, von λmax = 359 nm auf λmax = 395 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Kalibrierkurven von ethanolischen Flavonoidlösungen. (A) Morin und (B) Quercetin im Konzentrationsbereich Co = 2,5-100 μg/ml bei pH = 1,2 (in blau) (entspricht simulierter Magenflüssigkeit), pH = 6,8 (in rot) (entspricht simulierter Dünndarmflüssigkeit) und pH = 7,4 (in grün) (entspricht simulierter Dickdarmflüssigkeit). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die relative Konzentration von sauren und basischen aktiven Zentren/funktionellen Gruppen auf der Oberfläche der ungeladenen und geladenen Alkali-Lignin-Partikel wurde durch potentiometrische Titration bestimmt. Die Berechnungen basierten auf den äquivalenten Titriermittelvolumina, die durch die zweiten abgeleiteten differentiellen Titrationskurven bestimmt wurden (Abbildung 5). Die Werte der bestimmten pKa, die Konzentrationen der sauren (starken, schwachen, gesamten) funktionellen Gruppen sowie der pH- und pH-Wertpzc der Mikro- und Submikronpartikel sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Abbildung 5: Zweite abgeleitete differentielle potentiometrische Titrationskurven der unbeladenen und beladenen Lignin-Mikro-/Submikron-Partikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Parameter | Lignin-Mikropartikel | Morin-verkapselte Lignin-Mikropartikel | Lignin-Submikron-Partikel | Quercetin-verkapselte Lignin-Submikron-Partikel |
| VGl., mL | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (stark), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (schwach), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (gesamt), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (wässrige Suspension) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pH-Wertpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
Tabelle 1: Werte des äquivalenten Titriermittelvolumens (Veq), der negativen Base -10 Logarithmus der Säuredissoziationskonstante (pKa), der Konzentrationen der sauren (starken, schwachen, gesamten) funktionellen Gruppen (Aa, mgeq/g), des pH-Werts und des Ladungspunktes (pHpzc) der unbeladenen und beladenen Lignin-Mikro- und Submikronpartikel. Die Mikro- und Submikron-, unbeladenen und flavonoidbeladenen Ligninpartikel sind negativ geladen, da ihr pH-Wert >pH pzc beträgt.
Der Gesamtphenolgehalt (TPC), der mit einem modifizierten kolorimetrischen Folin-Ciocalteu-Verfahren bestimmt und als Gallussäureäquivalente berechnet wurde, betrug 78,2 mg GAE/g der ungeladenen Ligninpartikel, während der Wert von TPC der morinverkapselten Microcarrier mit der gleichen Konzentration 2,3-mal höher war (183,43 mg GAE/g). Letzteres deutet darauf hin, dass die Hetero-Biopolymer-Partikel durch den Einbau der Flavonoid-Moleküle mit zusätzlichen phenolischen Gruppen angereichert sind. Die Verkapselungseffizienz der Flavonoide betrug: 98,1 % für Morin und 97,6 % für Quercetin. Die Wirkstoffverkapselungskapazitäten betrugen 28,2 % für die morinbeladenen Mikropartikel und 39,0 % für die Quercetin-verkapselten Submikron-Partikel.
Die kumulative In-vitro-Freisetzung von Morin und Quercetin wurde in simulierten gastrointestinalen enzymfreien Medien untersucht: Magen-, Dünndarm- und Dickdarmflüssigkeiten bei pH = 1,2, 6,8 bzw. 7,4 (Abbildung 6). Die höchste Freisetzungseffizienz von ca. 24% wurde nach 30-40 min bei pH = 6,8 erreicht. Den experimentellen Ergebnissen zufolge überwog die Menge des freigesetzten Flavonoids im simulierten Dünndarmmedium doppelt so hoch wie in der simulierten Dickdarmumgebung und dreimal so hoch wie die im Magen ermittelte Freisetzungseffizienz. Das höchste Ausmaß der Quercetinfreisetzung, das in SIF bei pH = 7,4 in der 70. bis 90. Minute festgestellt wurde, betrug 34 %, was die kumulative Freisetzung des Flavonoids in SGF (pH = 1,2) und SIF (pH = 6,8) mit 23,5 % und 18 % respektvoll übertraf.
Abbildung 6: Vergleichende Analysen der kumulativen in vitro Freisetzungseffizienz von Morin und Quercetin aus Lignin-Mikro- und Submikron-Partikeln in simulierten physiologischen Medien. Das höchste Ausmaß der Morinfreisetzung wurde in simuliertem Dünndarmmedium erreicht. Die höchste Freisetzungseffizienz von Quercetin wurde in simulierter Dickdarmflüssigkeit registriert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Zu den wichtigsten kritischen Fragen moderner Synthesemethoden für das Design von Wirkstoffträgerformulierungen auf der Basis von Biopolymeren gehört die Verwendung gefährlicher organischer Reagenzien - flüchtiger und brennbarer Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran, Aceton, Methanol und sogar DMSO in hohen Konzentrationen -, was ihre Anwendbarkeit in der Biomedizin, pharmazeutischen Industrie und Lebensmitteltechnologie aufgrund der Manifestation möglicher toxischer Wirkungen einschränkt20, 21,22,23,24. Ein weiterer entscheidender Punkt ist die Beteiligung komplizierter chemischer Reaktionen (z.B. Veresterung, Polymerisation) oder teurer Apparaturen während des Syntheseprozesses. Beide Techniken, die in der vorliegenden Handschrift vorgestellt werden, überwinden die letztgenannten Einschränkungen durch die Einbeziehung alternativer Lösungsmittel (Wasser) und ungiftiger Verbindungen wie Tenside (Tween 80) und Vernetzungsmittel (Ethanol, Zitronensäure) und klassifizieren sie als "grüne" Synthesemethoden. Darüber hinaus bieten die Methoden eine Lösung, die der kritischen Notwendigkeit und dem Drang nach der Entwicklung kostengünstiger, umweltfreundlicher, nachhaltiger Verfahren für das Design von Ligninpartikeln gerecht wird, die als biologisch abbaubare, bioaktive und biokompatible Trägervorlagen für physiologisch aktive Substanzen dienen25.
Um Ligninpartikel mit der gewünschten Größe zu erhalten, wurden zwei Produktionsbedingungen gewählt: eine mit hoher Ligninkonzentration (50 g/L) und Salpetersäure als Lösungsmittel und eine andere mit niedrigerer Ligninkonzentration (5 g/L), Ethanol als Lösungsmittel und Zitronensäure, die gleichzeitig eine doppelte Rolle als Lösungsmittel und Vernetzungsmittel spielte, da dies die beiden Variablen waren, die die Größe der Ligninpartikel beeinflussten. Die Durchflussrate bei beiden Verfahren wurde niedrig gehalten, um kleinere Partikel zu erzeugen und deren Aggregation zu verhindern. Es gibt einige kritische Punkte, die bei der Wahl der anorganischen und organischen Säuren für die Syntheseprotokolle zu beachten sind.
Salpetersäure wurde gewählt, weil es sich um eine starke anorganische Säure handelt, die eine hohe Ausfällungsmenge an Alkalilignin aufweist und durch Kontrolle der Geschwindigkeit ihrer Zugabe Partikel innerhalb des gewünschten Größenbereichs erhalten werden können. Darüber hinaus wird erwartet, dass die Zugabe von HNO3 eine Modifikation der Heteropolymerpartikel aufgrund wahrscheinlicher chemischer Veränderungen der Ligninstruktur bewirken könnte, die mit folgenden Prozessen verbunden sind: Prozessen der Nitrations-Substitutionsreaktionen von H-Atomen in den Benzolringen mit -NO2-Gruppen ; Veresterung aliphatischer -OH-Gruppen und Bildung von funktionellen Estergruppen; und/oder Oxidation von phenolischen -OH- und -OCH3-Gruppen , die zur Bildung von Chinonstrukturen führen. Hinsichtlich der Rolle der Fällungsmittel- und Ligninkonzentration für die Größe der synthetisierten Partikel führte einerseits die höhere Anfangsligninkonzentration in Verbindung mit der Zugabe der starken Salpetersäure (pKa = -1,4) und die eingeschränkte Löslichkeit des Alkaliheteropolymers in der anorganischen Säure zur Bildung von Partikeln im Mikrometerbereich. Andererseits provoziert die Zugabe von Ethanol zur wässrigen Lösung von Alkalilignin mit der niedrigeren Konzentration die Bildung einer feinen Suspension aufgrund der teilweisen Löslichkeit von Alkalilignin im Alkohol. Darüber hinaus führte die nachträgliche Zugabe von Zitronensäure zur Bildung von Partikeln im Nanometerbereich, da die organische Säure schwächer (pKa1 = 3,13) als Salpetersäure ist und somit eine geringere Ausfällungsdauer bietet.
Einige grundlegende Eigenschaften von Pharmazeutika in Nanogröße sind die Zirkulation von Arzneimitteln, die Freisetzung von Arzneimitteln aus Darreichungsformen an bestimmten Stellen und die Absorption durch biologische Membranen. Diese Eigenschaften werden maßgeblich durch einige physikalische und chemische Eigenschaften der Nanopartikelträger und durch die verkapselten Wirkstoffmoleküle beeinflusst.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Biopolymerträgern: Konzentration der oberflächenaktiven sauren und basischen Gruppen, Punkt der Nullladung (pH PZC), Größe, Partikelgrößenverteilung sowie die spektralen Eigenschaften der Partikel vor und nach dem Einbau des bioaktiven Stoffes sind wesentliche Parameter, die bei der Bewertung der funktionellen Gruppen, der Reaktivität, Stabilität und Homogenität der Partikel10.
Partikelgröße, Partikelgrößenverteilung, Ladung und Morphologie gehören zu den Hauptfaktoren, die diese Bewertungen beeinflussen. Die Partikelgröße beeinflusst ihre Stabilität, Reaktivität und ihr Wirkstofffreisetzungsverhalten26. Kleinere Partikel bieten eine größere Stofftransportfläche, was zu einer höheren Wirkstofffreisetzungsrate führt. Im Gegensatz dazu führt die kleinere Stofftransportoberfläche größerer Partikel zu einer geringeren Diffusionsrate des Wirkstoffs in diesen Partikeln.
Die Anwendung titrimetrischer Methoden als grundlegende Techniken zur Bestimmung von sauren und basischen Stellen und funktionellen Gruppen, die auf festen Oberflächen vorhanden sind, wird ständig erweitert. Zu den Hauptvorteilen der potentiometrischen Titration gehören die Zeit- und Arbeitsersparnis, die hohe Präzision und der Wegfall von Referenzstandards und teuren Geräten. Die Methode wurde in der vorliegenden Arbeit angewendet, da sie die Charakterisierung von Biopolymerpartikeln durch qualitative und semiquantitative Bestimmung der Art und Anzahl der auf der Oberfläche von beladenen und ungeladenen Biopolymerträgern vorhandenen aktiven Zentren ermöglicht27.
Die Oberflächenladung biologischer und medizinischer Mikro-/Nano-Carrier spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Aufnahme28. Der pH-WertPZC entspricht der Oberflächenladungsdichte von Null, d.h. äquivalenten Mengen an negativen und positiven Ladungen, die durch Protonengleichgewichte entwickelt werden. Die Bestimmung dieser Werte gibt Aufschluss über die Spezifität der Adsorption29. Da der Parameter isoelektrischer Punkt jedoch nur die äußeren Oberflächenladungen von Partikeln in Suspension darstellt, während der Punkt der Nullladung in Abhängigkeit von der gesamten Netto-Oberflächenladung (extern und intern) der Partikel variiert, wurde in der vorliegenden Studie zum ersten Mal daspH-pzc-Protokoll als einfache und effektive Methode zur Charakterisierung von Biopolymer-Wirkstoffträgern angewendet. Nach dem Konzept despH-Werts pzc ist die Oberfläche der Biopolymerpartikel bei einem pH-Wert über dempH-Wert pzc überwiegend negativ geladen, während eine positive Nettoladung beobachtet wird, wenn der pH-Wert der Suspension unter dem pH-Wertpzc liegt. Aus den in Tabelle 1 dargestellten experimentellen Daten konnte geschlossen werden, dass die Mikro- und Submikron-, unbeladenen und flavonoidbeladenen Ligninpartikel negativ geladen sind, da ihr pH-Wert > pHpzc beträgt.
Die Effizienz der Flavonoidbeladung wird durch die Verkapselungseffizienz und die Beladungskapazität des Arzneimittels beeinflusst. Die Verkapselungseffizienz (E, %) ist definiert als das Verhältnis der Menge des in den Partikeln enthaltenen Arzneimittels zur Gesamtmenge in der Formulierung. Die Verkapselungseffizienz wird durch die Eigenschaften des Arzneimittels, das Lösungsmittel und den Träger30 beeinflusst.
Die effiziente Abgabe einer physiologisch aktiven Substanz hängt jedoch davon ab, wie und in welchem Umfang ihre Moleküle aus der Trägermatrix freigesetzt werden. Daher ist es sehr wichtig, den Freisetzungsmechanismus des Arzneimittels und die Freisetzungsrate zu berücksichtigen 31,32,33. Durch die Aufklärung des in vitro Freisetzungsmechanismus von Bioflavonoiden aus ihren biopolymeren Mikro-/Nanoträgern kann das Verhalten des Flavonoids und des Trägers in einem realen physiologischen Medium simuliert und vorhergesagt werden und das Design von pharmazeutischen Formulierungen mit verbesserter Bioverfügbarkeit optimiert werden. Die in dieser Studie erzielten experimentellen In-vitro-Ergebnisse sind für die klinische Praxis nützlich, da sie beweisen, dass aufgrund des geringeren Ausmaßes der Morin/Quercetin-Freisetzung aus Lignin-Submikron und Mikropartikeln im Magenmilieu die innovativen Biopolymerpartikel aufgrund des geringeren Risikos einer Magenreizung im Vergleich zur direkten oralen Verabreichung der bioaktiven Substanzen für die orale Verabreichung geeignet sind. Die innovativen Biopolymer-Mikropartikel eignen sich für die orale Verabreichung, da das Risiko einer Magenreizung im Vergleich zur direkten oralen Verabreichung der bioaktiven Substanzen geringer ist. Darüber hinaus könnten die Submikron-Partikel aufgrund ihrer geringen Größe und ihres signifikanten Freisetzungspotenzials als injizierbare Formulierungen eingesetzt werden. Darüber hinaus bieten die neuartigen Lignin-Mikro- und Submikron-Träger die Möglichkeit, die von anderen Wissenschaftlern berichteten Einschränkungen im Zusammenhang mit Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der oralen Verabreichung hoher Dosen bestimmter Bioflavonoide zu überwinden, die sich aus ihrer Tendenz ergeben, gesättigte Lösungen im Darmtrakt zu bilden, was wiederum den Auflösungsprozess und ihre effiziente Resorption behindert.
Die einfache Synthese, die Biokompatibilität der resultierenden Partikel sowie die Möglichkeit zur Anpassung des aktuellen Protokolls stellen die Hauptvorteile der vorgestellten Methodik dar. Die Größe der Partikel ist optimal für ihre beabsichtigten Anwendungen und bietet genügend Oberfläche für die Anlagerung von Therapeutika und Targeting-Einheiten, was wiederum nicht erfordert, dass mehr Partikel verabreicht werden, um die Zieldosierungsanforderungen zu erreichen. Die Verwendung von Lignin als grundlegende Heteropolymer-Matrix für die Synthese innovativer Partikel ermöglicht eine erhöhte Biokompatibilität und bietet verschiedene aktive funktionelle Gruppen, die Möglichkeiten zur Anpassung der Partikel für verschiedene Anwendungen bieten.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom Bulgarischen Wissenschaftsfonds unter der Vertragsnummer KΠ-06 H59/3 und vom Wissenschaftlichen Projekt Nr. 07/2023 FVM der Universität Trakia unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
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