Summary
我们描述了生物相容性木质素微米和亚微米颗粒的合成和表征的新颖、简单的方法。这些配方为杂质聚合物的利用提供了一种简单的方法，也为合理设计多功能载体基质提供了一种替代方案，在生物医学、制药技术和食品工业中具有潜在的适用性。
Abstract
由于生物聚合物基颗粒作为有效载体系统的巨大潜力，生物聚合物微/纳米技术在人类、兽医、制药和食品技术中的适用性正在迅速增长。使用木质素作为碱性杂聚物生物基质，用于设计创新的微/亚微米配方，可以提高生物相容性，并提供各种活性官能团，为定制配方的理化性质和生物活性提供机会，适用于各种应用。本研究的目的是开发一种简单且环保的方法，用于合成微米和亚微米尺寸的木质素颗粒;评估其理化、光谱和结构特性;并检查它们包封生物活性分子的能力以及在模拟胃肠道培养基中体 外释放生物 类黄酮的潜力。所提出的方法适用于廉价和绿色的溶剂;简单、直接、快速和灵敏的过程，只需很少的设备、无毒物质和简单的表征方法，即可测定对水溶性差的生物活性化合物桑酸和槲皮素的包封能力，以及木质素基质的 体外 释放潜力。
Introduction
如今，由于纤维素、壳聚糖、胶原蛋白、葡聚糖、明胶和木质素等生物聚合物作为设计具有可定制尺寸、物理化学特性和生物功能性的微/亚微米载体的前体，由于它们在组织工程、3D 生物打印、体外的适用性，在生物医学、制药和食品技术行业中有所增加疾病建模平台、包装行业、乳液制备和营养物质输送等 1,2,3.
新颖的研究强调了木质素基水凝胶以及微纳米制剂4 作为用于食品包装材料5、储能6、化妆品7、热/光稳定剂、增强材料和药物载体基质的有利载体8 用于输送疏水分子、改善紫外线阻隔剂9，作为纳米复合材料中的增强剂，以及由于最近的一些安全问题而作为无机纳米颗粒的替代品10,11,12。这种趋势背后的原因是天然生物聚合物的生物相容性、生物降解性和无毒性，以及其已证实的木质素抗氧化潜力和自由基清除、抗增殖和抗菌活性的生物活性 13,14,15,16,17。
科学文献报道了各种合成方法（自组装、抗溶剂沉淀、酸沉淀和溶剂转移）18 以及基于木质素的微/纳米级制剂的表征，包括使用昂贵或有害的溶剂，如四氢呋喃 （THF）、二甲基亚砜 （DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺 （DMF） 和丙酮，以及使用大量设备和有毒物质的复杂、间接和繁琐的过程12，19,20.
为了克服后一种缺点，以下协议提出了使用廉价和绿色溶剂合成木质素基微/亚微米颗粒的新方法;简单、直接、快速和灵敏的过程，只需很少的设备、无毒物质和简单的方法来表征和测定对水溶性差的生物活性化合物的包封能力和木质素基质的 体外 释放潜力。所提出的实验室规模生产方法有利于制造功能性木质素载体，这些载体具有可调的尺寸、高封装容量和可持续的 体外 释放行为，利用简单的表征程序和环保化学品，可以在生物医学科学和食品技术的各个领域找到应用。将两种黄酮类化合物作为靶分子封装在木质素颗粒中：桑苷封装在微粒中，槲皮素封装在亚微米颗粒中。两种黄酮类化合物结构的区别只是第二个-OH基团在B-芳环中的位置：-OH基团在桑苷中位于2'位置，在槲皮素中位于3'位置，因此两种有机化合物都是位置异构体。后一个事实假定两种生物活性天然化合物在包封和/或释放过程中具有相似的行为。
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Protocol
1.木质素微粒的合成
- 通过在磁力搅拌器上将 2.5 g 碱木质素溶解在 50 mL 超纯水中，制备 50 mg/mL 碱木质素水溶液。
- 通过将 1 mL 吐温 80 溶解在 100 mL 超纯水中来制备 1% 吐温 80 溶液。
- 用超纯水稀释 6.65 mL 的 67% HNO3（密度 = 1.413 g/mL）至最终体积为 50 mL 来制备 2 M 的 HNO3 溶液。
- 缓慢加入 15 mL 的 1% 吐温 80 溶液到 50 mL 的 50 mg/mL 碱木质素溶液中。
- 在磁力搅拌器上以 500 rpm 的速度搅拌混合物 10 分钟，使表面活性剂很好地分散。
- 用注射器以约 150 μL/s 的流速向混合物中滴加 20 mL 2 M HNO3 。
- 当深棕色溶液转化为微粒的浅棕色悬浮液时，继续搅拌混合物30分钟。
- 将悬浮液转移到1.5-2mL试管中，并在10°C的超速离心机中以15,000× g 离心30分钟。
- 收集上清液进行进一步分析，并用超纯水冲洗微粒。
- 重复冲洗/超速离心程序 3 次。
- 在超声波均质化之前，将装有微粒的容器浸入冰浴中。
- 在超声均质器上以93%的强度将微粒均质化4分钟。
- 在冷冻干燥机中在-64°C的温度下冻干微粒，并将它们储存在蒸馏器中以备进一步使用。
2. 木质素亚微米颗粒的合成
- 通过在磁力搅拌器上将 125 mg 碱木质素溶解在 25 mL 超纯水中，制备 5 mg/mL 碱木质素水溶液。
- 缓慢向碱木质素溶液中加入 1 mL 96% EtOH。
- 在磁力搅拌器上以 500 rpm 的速度搅拌混合物 3 分钟。
- 通过将 0.5 g 柠檬酸溶解在超纯水中至最终体积为 50 mL 来制备 50 mL 的 1% 柠檬酸溶液。
- 用注射器以大约 4 mL/min 的流速将 7 mL 1% 柠檬酸滴加到混合物中。
- 继续搅拌混合物 10 分钟，此时棕色透明溶液将转变为亚微米颗粒的混浊浅棕色悬浮液。
- 将悬浮液转移到试管中，并在10°C的超速离心机中以15,000× g 离心30分钟。
- 收集上清液进行进一步分析，并用超纯水冲洗微粒。
- 重复冲洗/超速离心程序 3 次。
- 在超声波均质化之前，将装有微粒的容器浸入冰浴中。
- 在超声均质器中以96%的强度超声均质化微粒两个周期，每个周期4分钟。
- 第一个循环后冷却容器 1 分钟。
- 在冷冻干燥机中在-64°C的温度下冻干微粒，并将它们储存在蒸馏器中以备进一步使用。
3. 天然黄酮包封木质素微/亚微米颗粒的合成
- 对微粒重复步骤1.1-1.5。
- 称取 0.08 g 桑林，将其溶解在 1 mL EtOH 中，然后将该乙醇溶液加入混合物中。
- 在磁力搅拌器上以 500 rpm 的速度搅拌混合物 20 分钟。
- 用注射器以约 150 μL/s 的流速向混合物中滴加 20 mL 2 N HNO3 。
- 继续搅拌混合物 60 分钟。
- 重复步骤 1.8-1.13。
- 对亚微米颗粒重复步骤 2.1。
- 称量 0.04 g 槲皮素，将其溶解在 1 mL EtOH 中，并将该乙醇溶液加入碱木质素水溶液中。
- 在磁力搅拌器上以 500 rpm 的速度搅拌混合物 10 分钟。
- 重复步骤 2.4-2.13。
4. 木质素微粒/超微粒包封效率的测定
- 计算在合成两种类型的类黄酮包封木质素颗粒的过程中添加的生物活性物质的含量。
- 用分光光度法测定在用96%EtOH稀释后在步骤1.9和2.8中获得的上清液中类黄酮的吸收。
- 使用黄酮类化合物的校准曲线计算未包埋的桑素/槲皮素的浓度。
- 使用公式（1）计算木质素微粒对天然黄酮类化合物的包封效率（EE，%）：
（一）
其中 wo 是添加的生物活性物质的总量 （mg），wf 是游离非包埋类黄酮的量 （mg）。 - 使用方程（2）计算载药量（DLC，%）-表示载体系统每单位重量颗粒中药物量的重要参数：
（二）
其中 wp 是冻干后获得的木质素微米/亚微米颗粒的总量（产量）（mg）。
（一）
（二）5. 木质素微米和亚微米颗粒的表征
- 颗粒数量、粒径和粒径分布的测定
- 使用带有微珠计数选项的自动池计数器评估样品的粒径和粒径分布。用微量移液管加入 1 μL 木质素/类黄酮微/亚微米颗粒悬浮液，在超纯水中加入操作所需的计数载玻片孔中。
- 等待 1 mL 悬浮液中的颗粒数量，以及它们的数量和按大小划分的分布显示在自动细胞计数仪的显示屏中。
注意： 该设备允许将数据存储在 USB 闪存上。自动细胞计数仪专用软件允许进一步处理保存的数字和照片文件。
- 通过电位滴定法测定木质素颗粒表面酸性/碱性基团的含量
- 重量 0.04 g 未负载/类黄酮包封的木质素颗粒。
- 将它们转移到锥形瓶中，加入 10 mL 0.1 M HCl，并将烧瓶以 250 rpm 的速度放在磁力搅拌器上。
- 用 0.1 M 滴定剂 NaOH 的标准溶液填充 50 mL 滴定管。
- 在开始滴定之前，用台式 pH 计测量锥形瓶中溶液的初始 pH 值。
- 开始滴定，并在每添加 0.5 mL 滴定剂部分后测量分析溶液的 pH 值。
- 将实验数据存储在包含所应用滴定剂体积和相应 pH 值的表格中。
- 当通过增加滴定剂溶液的体积达到 pH 值的近似恒定值时，停止滴定。
- 将实验数据以零、一阶导数和二阶导数差分滴定曲线的形式绘制出来。
- 确定所用滴定剂的当量点和相应的当量体积。
- 使用公式（3）和（4）计算未负载和类黄酮负载木质素颗粒表面的酸性A，a和A，b碱性基团的含量：
， mgeq/g （3）
MGEQ/克 （4）
其中 Veqi 是当量体积 （mL）;NT ， 滴定剂的正态度（mgeqv/mL）;VT ，用于测定程序的滴定剂体积 （mL）;m 分析样品的重量 （g）。
- 通过固体添加法测定木质素基颗粒的pH零电荷点（pHPZC）。
- 制备 60 mL 0.1 M NaCl 水溶液。
- 在五个带塞的锥形瓶中的每一个中加入 9 mL 的 0.1 M NaCl 溶液，并将 pH 调节至 pHi = 2、4、7、10 和 12（其中 i = 1-5 表示相应溶液的数量），分别通过加入 0.1 M HCl 或 0.1 M NaOH。通过加入相同强度的NaCl溶液，将每个烧瓶中溶液的总体积精确地调节至10mL。
- 向每个烧瓶中加入 40 mg 干燥木质素颗粒（未加载的、类黄酮负载的微/亚微米），并牢固地盖住烧瓶。
- 将烧瓶直立固定在轨道振荡器上，并保持摇动24小时。
- 让平衡 30 分钟，然后测量每个烧瓶中上清液的最终 pH 值 （pHf）。
- 将 pHf 值与相应的初始 pH 值 （pHi） 作图。
- 零电荷点 （pHPZC） 定义为曲线 ΔpH 与 pHi 与直线相交的 pH 值 （pHi; pHi）。
- 木质素颗粒中总酚含量（TPC）的测定
注：微/亚微米木质素颗粒的总酚含量 （TPC） 是通过改进的 Folin-Ciocalteu 比色法测定的。- 将 200 μL 浓度为 500 μg/mL 的颗粒水悬浮液与 600 μL 超纯水和 200 μL Folin-Ciocalteu 试剂 （1：1， v/v） 混合。
- 5分钟后，向混合物中加入1.0mL 8%Na2CO3 和1.0mL Milli-Q水，并在40°C的黑暗中在间歇搅拌的水浴中孵育30分钟。
- 将悬浮液以 5,300 × g 离心 2 分钟。
- 准备一个不含颗粒的空白。
- 在 10 mm 石英比色皿中转移 3.5 mL 上清液，并在 UV/Vis 分光光度计上测量 760 nm 可见区域对空白的吸光度。
- 按照步骤5.3.1-5.3.5制备标准没食子酸的校准曲线;仅使用初始浓度为 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150 和 200 μg/mL 的没食子酸乙醇溶液，而不是 200 μL 木质素颗粒悬浮液。
- 将微粒的实验数据表示为没食子酸当量的毫克数，单位为毫克/克干样品（mg GAE/g）。
- 使用公式 （5） 计算 TPC：
毫克GAE/克 （5）
式中，CGA 是样品的浓度，相当于从酸的校准图中获得的标准没食子酸的浓度（μg GA/mL）;Cs 是样品的浓度，等于干样品质量除以溶剂体积 （μg/mL）。
， mgeq/g （3）
MGEQ/克 （4）
毫克GAE/克 （5）6.木质素颗粒体外释放能力的测定
- 通过将用0.1M HCl调节标准PBS溶液的pH至pH = 1.2，制备250mL模拟的无酶胃培养基。
- 通过用 0.1 M NaOH/0.1 M HCl 调节标准 PBS 溶液的 pH 值至 pH = 6.8 和 7.4，制备两种模拟肠液溶液中的每一种 250 mL。
- 在配有机械搅拌器的玻璃间歇反应器中，将 25 mg 类黄酮包封的微/亚微米颗粒加入 50 mL 模拟无酶胃培养基中，并将其置于恒定温度为 T = 37 ± 0.2 oC 的热水浴中。
- 将搅拌器浸入液体体积的 2/3 深度，以确保固相和液相完全混合，并确保最大的传质，而不会出现停滞区。
- 每 10 分钟至第 90 分钟从反应器中取出 1 mL 样品，并立即将 1 mL 新鲜模拟流体溶液移液到反应器中，以防止总体积变化并确保下沉条件。
- 重复相同的过程，包括步骤6.3-6.6，分别使用pH = 6.8和7.4的两种模拟肠液溶液，持续200分钟。
- 在三种模拟培养基中对未加载的木质素颗粒进行类似实验，并将样品用作空白，用于将分光光度计归零。
- 过滤样品并用96%EtOH稀释样品对步骤6.7的空白样品后，通过分光光度法测定样品的吸收，并使用在pH = 1.2,6.8和7.4下获得的桑林的相应校准曲线计算相应的类黄酮浓度。
- 使用公式（6）计算生物类黄酮的累积释放量（CR），单位为μg/mL，使用公式（7）计算累积释放百分比（CRP）：
(6)
其中 Ci 和 Ci+1 是第 i 个 和第 （i+1） 个 样品中桑酸/槲皮素的浓度 （μg/mL）;Vs 从间歇式反应器中取出的样品体积 （mL）;V 模拟培养基的总体积 （mL）。
（7）
其中 Cmax 是载体中生物活性化合物的最大浓度 （μg/mL）。
(6)
（7）7. 统计分析
- 将实验数据表示为三个独立测量值的均值±标准差 （SD）。
- 通过执行方差分析检验作为事后检验来确定实验结果的统计显着性。考虑 p 的值< 0.05 具有统计显著性。
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Representative Results
执行反溶剂沉淀技术以产生碱木质素微米/亚微米颗粒。将稀释的无机酸-硝酸/有机酸-柠檬酸水溶液分散到碱木质素水溶液中，并富集环保表面活性剂/乙醇，导致生物聚合物溶质逐渐沉淀，超声处理后，最终产生致密的微米/亚微米颗粒悬浮液（图1）。
图1：木质素颗粒的均质化。 （A）合成的木质素亚微米颗粒的超声均质化;（B）均质化的桑林负载和卸载木质素微粒。 请点击这里查看此图的较大版本.
确定了卸载和桑林包封的木质素微载体的大小、数量和大小分布（图2）。实验数据证明×，与浓度为7.4 × 10 6 个颗粒/mL（1,474 个颗粒/μL）和平均尺寸为 5.7 μm（图 2A）的未负载微载体相比，负载生物类黄酮的微载体（图 2B）浓度为 106 个颗粒/mL（2,037 个颗粒/μL），平均大小为 6.1 μm。在3-6 μm粒径范围内，两种颗粒的粒径分布分别为75.2%和69.3%，在7-10 μm范围内分别为20.2%和25.2%。反溶剂硝酸的数量、浓度和流速对于颗粒的大小至关重要。较高的酸浓度和较多的量导致更大的颗粒，而较高的流速会引起悬浮液的聚集。
图 2：粒径分布。 （A） 颗粒计数器的1 μL悬浮液中卸载木质素微粒的实际粒径分布;（B）桑林包封的碱木质素微粒在1 μL颗粒计数器的悬浮软件中的实际粒径分布。（C）卸载木质素微粒分布的粒子计数器显微照片;（D）桑林包封的碱木质素微粒分布的粒子计数器显微照片。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3显示了乙醇桑酸桑苷溶液、碱性木质素水溶液以及含有不同初始浓度的桑酸和木质素的混合物的紫外/可见吸收光谱。显然，纯木质素和生物类黄酮的吸收峰不重合，杂聚物在应用分光光度法测定黄酮包封到聚合物微载体后液相中桑酸浓度以及体外释放实验中不会产生任何破坏性影响。由于碱木质素的存在导致培养基的pH值升高，双组分混合物中桑酸的最大吸收向更高的波长移动，从λmax = 359 nm变为λmax = 395 nm。可见光区域吸收最大值的后一种偏差引发了在培养基的不同pH值下设计桑苷校准曲线的必要性（图4A）。在桑林浓度范围Co = 2.5-100 μg/mL内，回归系数（R2 > 0.99）较高，证明了三条标准曲线具有非常强的线性相关性。同样，图4B所示的三个模拟生理室中槲皮素的三个标准曲线在相同的浓度范围内显示出高线性。
图3：桑酸乙醇溶液、碱木质素水溶液以及含有不同初始浓度的桑酸和木质素混合物的紫外/可见光谱比较。 纯木质素和桑树苷的光谱不重合，杂聚物不会产生任何破坏性影响。将木质素添加到桑林中导致桑林的最大吸收转移到更高的波长，从 λmax = 359 nm 到 λmax = 395 nm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：乙醇类黄酮溶液的校准曲线。 （A）桑素和（B）槲皮素在浓度范围Co = 2.5-100μg/mL时，pH = 1.2（蓝色）（对应于模拟胃液），pH = 6.8（红色）（对应于模拟小肠液），pH = 7.4（绿色）（对应于模拟结肠液）。 请点击这里查看此图的较大版本.
通过电位滴定法测定卸载和负载的碱性木质素颗粒表面酸性和碱性活性位点/官能团的相对浓度。计算基于由二阶导数差滴定曲线确定的等效滴定剂体积（图5）。测定的 pKa 值、酸性（强、弱、总）官能团的浓度以及微米和亚微米颗粒的 pH 和 pHpzc 如 表 1 所示。
图 5：卸载和负载木质素微/亚微米颗粒的二阶导数差分电位滴定曲线。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 参数 | 木质素微粒 | 桑林包封的木质素微粒 | 木质素亚微米颗粒 | 槲皮素包封的木质素亚微米颗粒 |
| V当量，mL | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| 酸度系数（pKa） | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa（强），mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa（弱），mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa（总计），mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH（水性悬浮液） | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pH值：pzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
表 1：滴定剂当量体积 （Veq）、酸解离常数的负碱基 -10 对数 （pKa）、酸性（强、弱、总）官能团浓度 （Aa， mgeq/g）、pH 值和零电荷点 （pH pzc） 的值，这些值来自卸载和负载的木质素微米和亚微米颗粒。 微米和亚微米、未负载和类黄酮负载的木质素颗粒带负电荷，因为它们的 pH 值>pH pzc。
采用改进的Folin-Ciocalteu比色法测定并按没食子酸当量计算的总酚含量（TPC）为卸载木质素颗粒的78.2 mg GAE/g，而相同浓度的桑林包封微载体的TPC值为2.3倍（183.43 mg GAE/g）。后者表明，由于掺入了类黄酮分子，杂质生物聚合物颗粒富含额外的酚类。黄酮包封效率为：桑苷为98.1%，槲皮素为97.6%。桑林负载微粒的药物包封能力为28.2%，槲皮素包封亚微米颗粒的药物包封率为39.0%。
在模拟的胃肠道无酶培养基中研究了桑林和槲皮素的体外累积释放：分别在pH = 1.2,6.8和7.4的胃，小肠和结肠液中（图6）。在 pH = 6.8 下 30-40 分钟后，最高释放效率约为 24%。根据实验结果，在模拟小肠培养基中释放的黄酮量是模拟结肠环境中释放量的两倍，在胃中测定的释放效率是该量的三倍。在70-90min时，pH = 7.4时，SIF中确定的槲皮素释放的最高程度为34%，超过了SGF（pH = 1.2）和SIF（pH = 6.8）中黄酮类化合物的累积释放量（23.5%和18%）。
图6：桑酸和槲皮素在模拟生理培养基中从木质素微米和亚微米颗粒中累积 的体外 释放效率的比较分析。 在模拟的小肠培养基中，桑蛋白释放程度最高。槲皮素在模拟结肠液中的释放效率最高。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
用于设计基于生物聚合物的药物载体制剂的现代合成方法的主要关键问题之一是使用有害的有机试剂 - 挥发性和易燃溶剂，如四氢呋喃、丙酮、甲醇，甚至高浓度的DMSO - 由于可能具有毒性作用的表现，这限制了它们在生物医学、制药工业和食品技术中的适用性20， 21,22,23,24.另一个关键点是复杂的化学反应（例如，酯化、聚合）或合成过程中昂贵的设备。当前手稿中介绍的两种技术都克服了后一种限制，因为它采用了替代溶剂（水）和无毒化合物，如表面活性剂（吐温80）和交联剂（乙醇、柠檬酸），将它们归类为“绿色”合成方法。此外，这些方法提供了一种解决方案，满足了开发廉价、环保、可持续的木质素颗粒设计程序的关键必要性和紧迫性，这些程序可作为生理活性物质的生物降解、生物活性和生物相容性载体模板25。
为了获得所需尺寸的木质素颗粒，选择了两种生产条件：一种是木质素浓度高（50 g/L）和硝酸作为抗溶剂剂，另一种是木质素浓度较低（5 g/L），乙醇作为抗溶剂，柠檬酸同时发挥反溶剂和交联剂的双重作用，因为这是影响木质素颗粒尺寸的两个变量。两个过程中的流速都保持较低，以提供更小的颗粒并防止其聚集。在选择合成方案的无机酸和有机酸时，必须考虑一些关键点。
之所以选择硝酸，是因为它是一种强无机酸，它提供了碱木质素的高程度沉淀，并且通过控制其添加速率可以在所需的尺寸范围内获得颗粒。此外，由于木质素结构可能发生的化学变化，预计HNO3 的添加可以提供杂聚物颗粒的改性，这些变化与以下因素有关：具有-NO2 基团的苯环中H原子的硝化取代反应过程;脂肪族-OH基团的酯化和酯官能团的形成;和/或酚 -OH 和 -OCH3 基团的氧化导致醌结构的形成。关于沉淀剂和木质素浓度对合成颗粒尺寸的作用，一方面，较高的初始木质素浓度与强硝酸（pKa = -1.4）的加入以及碱杂聚物在无机酸中的有限溶解度相结合，导致产生微米级的颗粒。另一方面，由于碱木质素在醇中的部分溶解度，将乙醇添加到较低浓度的碱木质素水溶液中会引起细悬浮液的形成。此外，随后添加柠檬酸导致产生纳米范围内的颗粒，因为有机酸比硝酸弱 （pKa1 = 3.13），因此提供较低的降水扩展。
纳米药物的一些基本特性是药物循环、药物在特定部位从剂型中释放以及通过生物膜吸收。这些特性受到纳米颗粒载体的一些物理和化学特性以及封装的药物分子的相当大的影响。
生物聚合物载体的理化特性：表面活性酸基和碱性基团的浓度、零电荷点（pHPZC）、大小、粒径分布，以及生物活性物质掺入前后颗粒的光谱特性，是评估官能团、反应性、 颗粒的稳定性和均匀性10.
粒径、粒径分布、电荷和形态是影响这些评估的主要因素。粒径影响其稳定性、反应性和药物释放行为26.较小的颗粒提供更大的传质面积，从而导致更高的药物释放率。相反，较大颗粒的传质表面积较小，导致这些颗粒内的药物扩散速率较低。
滴定法作为测定固体表面上存在的酸性和碱性位点和官能团的基本技术的应用正在不断扩大。电位滴定法的主要优点包括省时省力、精度高，并且无需参考标准品和昂贵的仪器。该方法在本研究中得到应用，因为它允许通过定性和半定量测定负载和卸载生物聚合物载体表面上存在的活性位点的性质和数量来表征生物聚合物颗粒27。
生物和医学微/纳米载体的表面电荷在细胞摄取中起着重要作用28.pHPZC 对应于零表面电荷密度，即质子平衡产生的等量的负电荷和正电荷。这些值的测定提供了关于吸附特异性的信息29。然而，由于参数等电点仅代表悬浮液中颗粒的外表面电荷，而零电荷点响应于颗粒的总净表面电荷（外部和内部）而变化，因此pHpzc 协议作为表征生物聚合物药物载体的简单有效的方法首次得到应用。根据 pHpzc 的概念，当 pH 高于 pHpzc 时，生物聚合物颗粒的表面主要带负电荷，而当悬浮液的 pH 值低于 pHpzc 时，观察到净正电荷。从 表1所示的实验数据可以得出结论，微米和亚微米、未负载和类黄酮负载的木质素颗粒具有负电荷，因为它们的pH值>pHpzc。
黄酮负载效率受包封效率和药物负载能力的影响。包封效率 （E， %） 定义为颗粒中掺入的药物量与制剂中的总量之比。包封效率受药物特性、溶剂和载体30的影响。
然而，生理活性物质的有效递送取决于其分子从载体基质中释放的方式和程度。因此，考虑药物释放机制和释放速率31,32,33非常重要。通过阐明生物类黄酮从其生物聚合物微/纳米载体中体外释放的机制，可以模拟和预测类黄酮和载体在真实生理培养基中的行为，并优化具有更高生物利用度的药物制剂设计。本研究获得的体外实验结果对临床实践很有用，因为它们证明，由于胃环境中木质素亚微米和微粒的桑林/槲皮素释放程度较低，创新的生物聚合物颗粒适合口服给药，因为与直接口服给药生物活性物质相比，胃刺激的风险较低。创新的生物聚合物微粒适合口服给药，因为与直接口服给药生物活性物质相比，胃刺激的风险较低。此外，亚微米颗粒由于其小尺寸和显着的释放潜力，可以作为注射制剂应用。此外，新型木质素微米和亚微米载体提供了一个机会，可以克服其他科学家报告的与口服某些生物类黄酮相关的困难相关的限制，这是由于它们倾向于在肠道中形成饱和溶液，这反过来阻碍了溶解过程及其有效吸收。
易于合成、所得颗粒的生物相容性以及定制当前方案的可能性，代表了所提出的方法的主要优点。颗粒的大小对于其预期应用来说是最佳的，为治疗剂和靶向部分的附着提供了足够的表面积，这反过来又不需要施用更多的颗粒来达到目标剂量要求。使用木质素作为合成创新颗粒的基本杂聚物基质可以提高生物相容性，并提供各种活性官能团，为各种应用定制颗粒提供了机会。
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Disclosures
作者没有要披露的利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了保加利亚科学基金的支持，合同编号为 KΠ-06 H59/3，并得到了特拉基亚大学科学项目编号 07/2023 FVM 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
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