Summary
Biyouyumlu lignin mikro ve mikron altı partiküllerin sentezi ve karakterizasyonu için yeni, basit metodolojileri açıklıyoruz. Bu formülasyonlar, heteropolimerin kullanımı için kolay bir yaklaşımın yanı sıra biyotıp, farmasötik teknoloji ve gıda endüstrisinde potansiyel uygulanabilirliği olan çok işlevli taşıyıcı matrislerin rasyonel tasarımı için bir alternatif sağlar.
Abstract
Biyopolimer mikro/nano teknolojinin insan, veterinerlik, ilaç ve gıda teknolojisinde uygulanabilirliği, biyopolimer bazlı partiküllerin etkili taşıyıcı sistemler olarak büyük potansiyeli nedeniyle hızla artmaktadır. Yenilikçi mikro-/mikron altı formülasyonların tasarımı için ligninin temel bir heteropolimer biyomatris olarak kullanılması, artan biyouyumluluğun elde edilmesini sağlar ve çeşitli uygulamalar için formülasyonların fizikokimyasal özelliklerinin ve biyoaktivitelerinin özelleştirilmesi için fırsatlar sunan çeşitli aktif fonksiyonel gruplar sunar. Bu çalışmanın amacı, mikro ve mikron altı boyuta sahip lignin parçacıklarının sentezi için basit ve çevre dostu bir metodoloji geliştirmekti; fizikokimyasal, spektral ve yapısal özelliklerini değerlendirmek; ve biyolojik olarak aktif moleküllerin kapsüllenme kapasitelerini ve simüle edilmiş gastrointestinal ortamlarda biyoflavonoidlerin in vitro salınım potansiyellerini incelemek. Sunulan metodolojiler ucuz ve yeşil çözücüler uygular; Az ekipman, toksik olmayan maddeler ve bunların karakterizasyonu için basit yöntemler gerektiren kolay, anlaşılır, hızlı ve hassas süreçler, suda az çözünür biyoaktif bileşikler morin ve kersetine karşı kapsülleme kapasitesinin belirlenmesi ve lignin matrislerinin in vitro salım potansiyeli.
Introduction
Günümüzde, doku mühendisliği, 3D biyo-printing, in vitro olarak uygulanabilirlikleri nedeniyle biyomedikal, farmasötik ve gıda teknolojisi endüstrilerinde özelleştirilebilir boyut, fizikokimyasal özellikler ve biyoişlevselliklere sahip mikro/mikron altı taşıyıcıların tasarımının öncüsü olarak selüloz, kitosan, kollajen, dekstran, jelatin ve lignin gibi biyopolimerlere olan eğilim artmıştır Hastalık modelleme platformları, ambalaj endüstrisi, emülsiyon hazırlama ve diğerleri arasında besin dağıtımı 1,2,3.
Yeni çalışmalar, lignin bazlı hidrojellerin yanı sıra mikro ve nano formülasyonların4 gıda ambalaj malzemeleri5, enerji depolama6, kozmetik7, termal/ışık stabilizatörleri, güçlendirilmiş malzemeler ve ilaç taşıyıcı matrisler8 için hidrofobik moleküllerin verilmesi, UV bariyerlerinin iyileştirilmesi için kullanılan avantajlı araçlar olarak yönlerini vurgulamaktadır9, nanokompozitlerde takviye maddeleri olarak ve bazı yeni güvenlik sorunları nedeniyle inorganik nanopartiküllere alternatif olarak 10,11,12. Bu eğilimin arkasındaki neden, doğal hetero biyopolimerin biyouyumluluğu, biyolojik olarak parçalanabilirliği ve toksik olmamasının yanı sıra lignin-antioksidan potansiyeli ve radikal süpürücü, anti-proliferatif ve antimikrobiyal aktivitelerin kanıtlanmış biyoaktiviteleridir 13,14,15,16,17.
Bilimsel literatür, tetrahidrofuran (THF), dimetil sülfoksit (DMSO), N, N-dimetilformamid (DMF) ve aseton gibi pahalı veya zararlı çözücülerin uygulanması ve çok sayıda ekipman ve toksik madde kullanan karmaşık, dolaylı ve sıkıcı süreçler dahil olmak üzere lignin bazlı mikro/nano ölçekli formülasyonların sentezi (kendi kendine montaj, anti-çözücü çökeltme, asit çökeltme ve çözücü kaydırma)18 ve lignin bazlı mikro/nano ölçekli formülasyonların karakterizasyonu için çeşitli yöntemler bildirmektedir,19,20.
İkinci dezavantajların üstesinden gelmek için, aşağıdaki protokoller, ucuz ve yeşil çözücüler kullanılarak lignin bazlı mikro-/mikron altı parçacıkların sentezi için yeni metodolojiler sunar; Az ekipman, toksik olmayan maddeler ve bunların karakterizasyonu ve suda az çözünür biyoaktif bileşiklere doğru kapsülleme kapasitesinin belirlenmesi ve lignin matrislerinin in vitro salım potansiyeli için basit yöntemler gerektiren kolay, anlaşılır, hızlı ve hassas işlemler. Sunulan laboratuvar ölçekli üretim yöntemleri, biyomedikal bilimlerin ve gıda teknolojisinin çeşitli alanlarında uygulama bulabilen basit karakterizasyon prosedürleri ve çevre dostu kimyasallar kullanılarak ayarlanabilir boyutlara, yüksek kapsülleme kapasitesine ve sürdürülebilir in vitro salım davranışına sahip fonksiyonel lignin taşıyıcılarının üretimi için avantajlıdır. Lignin parçacıklarına kapsüllenmiş hedef moleküller olarak iki flavonoid uygulandı: mikropartiküllere morin ve mikron altı partiküllere quercetin. Her iki flavonoidin yapılarındaki fark, yalnızca B-aromatik halkadaki ikinci -OH grubunun konumudur: -OH grubu, morinde 2' konumunda ve quercetin'de 3' konumundadır, bu nedenle her iki organik bileşik de konumsal izomerlerdir. İkinci gerçek, her iki biyoaktif doğal bileşiğin kapsülleme ve/veya salma süreçlerinde benzer davranışlarını varsayar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lignin mikropartiküllerinin sentezi
- 2.5 g alkali lignini manyetik bir karıştırıcı üzerinde 50 mL ultra saf su içinde çözerek 50 mg / mL alkali lignin sulu çözeltisi hazırlayın.
- 1 mL Tween 80'i 100 mL ultra saf suda çözerek %1 Tween 80 solüsyonu hazırlayın.
- 6.65 mL% 67 HNO3'ü (yoğunluk = 1.413 g / mL) ultra saf su ile 50 mL'lik bir nihai hacme seyrelterek 2 M'lik birHNO3 çözeltisi hazırlayın.
- % 1 Tween 80 çözeltisinin 15 mL'sini 50 mg / mL alkali lignin çözeltisinin 50 mL'sine yavaşça ekleyin.
- Karışımı, yüzey aktif maddenin iyi dağılması için 500 rpm'de 10 dakika boyunca manyetik bir karıştırıcı üzerinde çalkalayın.
- Karışıma yaklaşık 150 μL/s akış hızında bir şırınga ile damla damla 20 mL 2 M HNO3 ekleyin.
- Koyu kahverengi çözelti açık kahverengi bir mikropartikül süspansiyonuna dönüştüğünde karışımı 30 dakika karıştırmaya devam edin.
- Süspansiyonu 1.5-2 mL test tüplerine aktarın ve 10 ° C'de bir ultrasantrifüjde 15.000 × g'da 30 dakika santrifüjleyin.
- Daha fazla analiz için süpernatanı toplayın ve mikropartikülleri ultra saf suyla durulayın.
- Durulama/ultrasantrifüj prosedürlerini 3 kez tekrarlayın.
- Ultrasonik homojenizasyondan önce kabı mikropartiküllerle birlikte bir buz banyosuna batırın.
- Mikropartikülleri bir ultrason homojenizatöründe %93 yoğunlukta 4 dakika boyunca homojenize edin.
- Mikropartikülleri bir dondurarak kurutucuda -64 °C sıcaklıkta liyofilize edin ve daha sonra kullanmak üzere bir ekzolatörde saklayın.
2. Lignin mikron altı parçacıklarının sentezi
- 125 mg alkali lignini manyetik bir karıştırıcı üzerinde 25 mL ultra saf suda çözerek 5 mg / mL alkali lignin sulu çözeltisi hazırlayın.
- Alkali lignin çözeltisine yavaşça 1 mL %96 EtOH ekleyin.
- Karışımı manyetik bir karıştırıcıda 500 rpm'de 3 dakika çalkalayın.
- 0.5 g sitrik asidi ultra saf suda 50 mL'lik bir nihai hacme kadar çözerek 50 mL'lik %1'lik bir sitrik asit çözeltisi hazırlayın.
- Karışıma yaklaşık 4 mL / dak akış hızında bir şırınga ile damla damla 7 mL %1 sitrik asit ekleyin.
- Kahverengi berrak çözelti, mikron altı parçacıkların bulanık açık kahverengi bir süspansiyonuna dönüşeceği zaman karışımı 10 dakika karıştırmaya devam edin.
- Süspansiyonu test tüplerine aktarın ve 10 ° C'de bir ultrasantrifüjde 15.000 × g'da 30 dakika santrifüjleyin.
- Daha fazla analiz için süpernatanı toplayın ve mikropartikülleri ultra saf suyla durulayın.
- Durulama/ultrasantrifüj prosedürlerini 3 kez tekrarlayın.
- Ultrasonik homojenizasyondan önce kabı mikropartiküllerle birlikte bir buz banyosuna batırın.
- Mikropartikülleri bir ultrason homojenizatöründe her biri %96 yoğunlukta 4 dakikalık iki döngü boyunca ultrasonik olarak homojenize edin.
- İlk döngüden sonra kapları 1 dakika soğutun.
- Mikropartikülleri bir dondurarak kurutucuda -64 °C sıcaklıkta liyofilize edin ve daha sonra kullanmak üzere bir ekzolatörde saklayın.
3. Doğal flavonoid kapsüllü lignin mikro-/mikron altı partiküllerinin sentezi
- Mikropartiküller için 1.1-1.5 adımlarını tekrarlayın.
- 0.08 g morin tartın, 1 mL EtOH içinde çözün ve bu etanolik çözeltiyi karışıma ekleyin.
- Karışımı manyetik bir karıştırıcıda 500 rpm'de 20 dakika çalkalayın.
- Karışıma yaklaşık 150 μL/s akış hızında bir şırınga ile damla damla 2 NHNO3 ilave edin.
- Karışımı 60 dakika karıştırmaya devam edin.
- 1.8-1.13 adımlarını tekrarlayın.
- Mikron altı parçacıklar için adım 2.1'i tekrarlayın.
- Ağırlık 0.04 g quercetin, 1 mL EtOH içinde çözün ve bu etanolik çözeltiyi alkali lignin sulu çözeltisine ekleyin.
- Karışımı manyetik bir karıştırıcıda 500 rpm'de 10 dakika çalkalayın.
- 2.4-2.13 adımlarını tekrarlayın.
4. Lignin mikro-/sumikro- partiküllerinin kapsülleme verimliliğinin belirlenmesi
- Her iki tip flavonoid kapsüllenmiş lignin partikülünün sentezi için prosedür sırasında eklenen biyoaktif maddenin içeriğini hesaplayın.
- % 96 EtOH ile seyreltildikten sonra 1.9 ve 2.8 adımları sırasında elde edilen süpernatanttaki flavonoidin emilimini spektrofotometrik olarak belirleyin.
- Flavonoidlerin kalibrasyon eğrilerini kullanarak hapsedilmemiş morin / quercetin konsantrasyonunu hesaplayın.
- Denklem (1)'i kullanarak lignin mikropartiküllerinin doğal flavonoidlere doğru kapsülleme verimliliğini (EE, %) hesaplayın:
(1)
Buradawo , eklenen biyoaktif maddenin toplam miktarıdır (mg) ve wf , serbest hapsedilmemiş flavonoidin (mg) miktarıdır. - Taşıyıcı sistemin birim ağırlığı başına partiküllerdeki ilaç miktarını temsil eden önemli bir parametre olan ilaç yükleme kapasitesini (DLC, %) denklem (2) kullanarak hesaplayın:
(2)
Burada wp , liyofilizasyondan (mg) sonra elde edilen lignin mikro-/mikron altı partiküllerinin toplam miktarıdır (verim).
(1)
(2)5. Lignin mikro ve mikron altı partiküllerin karakterizasyonu
- Partikül sayısı, boyutu ve boyut dağılımının belirlenmesi
- Boncuk sayımı seçeneğine sahip otomatik hücre sayacı kullanarak numunelerin partikül boyutunu ve partikül boyutu dağılımını değerlendirin. İşlem için gerekli sayma slaytının kuyusuna ultra saf su içinde 1 μL lignin/flavonoid mikro-/mikron altı partikül süspansiyonunu bir mikropipet ile ekleyin.
- Süspansiyonun 1 mL'sindeki partikül sayısının yanı sıra boyuta göre sayılarının ve dağılımlarının otomatik hücre sayacının ekranında gösterilmesini bekleyin.
NOT: Cihaz, verilerin bir USB flaşta saklanmasına izin verir. Otomatik hücre sayacı özel yazılımı, kaydedilen dijital ve fotoğraf dosyalarının daha fazla işlenmesine izin verir.
- Potansiyometrik titrasyon ile lignin partiküllerinin yüzey asidik/bazik gruplarının içeriğinin belirlenmesi
- Ağırlık 0.04 g yüksüz / flavonoid kapsüllenmiş lignin parçacıkları.
- Bunları bir Erlenmeyer şişesine aktarın, 10 mL 0.1 M HCl ekleyin ve şişeyi 250 rpm'de manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin.
- 50 mL'lik bir büreti 0,1 M'lik standart bir NaOH titrantı çözeltisiyle doldurun.
- Titrasyona başlamadan önce Erlenmeyer şişesindeki çözeltinin ilk pH'ını bir tezgah pH metre ile ölçün.
- Titrasyonu başlatın ve titrantın eklenen her 0,5 mL kısmından sonra analiz edilen çözeltinin pH değerini ölçün.
- Deneysel verileri, uygulanan titrasyon çözeltisinin hacmini ve karşılık gelen pH değerini içeren bir tabloda saklayın.
- Titrant çözeltisinin hacmi artırılarak yaklaşık olarak sabit bir pH değerine ulaşıldığında titrasyonu durdurun.
- Deneysel verileri sıfır, birinci ve ikinci türev diferansiyel titrasyon eğrileri şeklinde çizin.
- Kullanılan titrantların eşdeğer noktalarını ve karşılık gelen eşdeğer hacimlerini belirleyin.
- Denklem (3) ve (4)'ü kullanarak yüksüz ve flavonoid yüklü lignin parçacıklarının yüzeyindeki asidik A,ave Abbazik gruplarının içeriğini hesaplayın:
, MGEQ/G (3)
MGEQ/G (4)
Veqi eşdeğer hacim (mL) olduğunda; NT titrantın normalliği (mgeqv/mL); VT : belirleme prosedürü için kullanılan titrasyon çözeltisinin hacmi (mL); m Analiz edilen numunenin ağırlığı (g).
- Lignin bazlı partiküllerin sıfır yükünün (pHPZC) pH noktasının katı ekleme yöntemi ile belirlenmesi.
- 60 mL 0.1 M sulu NaCl çözeltisi hazırlayın.
- Beş durduruculu erlenin her birine 9 mL 0.1 M NaCl çözeltisi ekleyin ve pH'ı pHi = 2, 4, 7, 10 ve 12'ye ayarlayın (burada i = 1-5 karşılık gelen çözeltinin sayısını gösterir), sırasıyla 0.1 M HCl veya 0.1 M NaOH ilavesiyle. Her bir şişedeki çözeltinin toplam hacmini, aynı kuvvette NaCl çözeltisi ekleyerek tam olarak 10 mL'ye ayarlayın.
- Her şişeye 40 mg kuru lignin parçacığı (yüksüz, flavonoid yüklü mikro- / mikron) ekleyin ve şişeleri güvenli bir şekilde kapatın.
- Şişeleri bir orbital çalkalayıcıya dik olarak sabitleyin ve 24 saat boyunca sallayın.
- 30 dakika dengeye izin verin ve ardından her şişedeki süpernatanların son pH'ını (pHf) ölçün.
- pHf değerlerini, karşılık gelen başlangıç pH değerlerine (pHi) göre çizin.
- Sıfır yük noktası (pHPZC), pHi'ye karşı ΔpH eğrisinin düz çizgiyi koordinatlarla (pHi; pHi) kestiği pH değeri olarak tanımlanır.
- Lignin partiküllerinin toplam fenolik içeriğinin (TPC) belirlenmesi
NOT: Mikro-/mikron altı lignin partiküllerinin toplam fenolik içeriği (TPC), modifiye edilmiş bir Folin-Ciocalteu kolorimetrik yöntemi ile belirlenir.- 500 μg/mL konsantrasyonda 200 μL sulu partikül süspansiyonunu 600 μL ultra saf su ve 200 μL Folin-Ciocalteu reaktifi (1:1, h/v) ile karıştırın.
- 5 dakika sonra, karışıma 1.0 mL% 8 Na2CO3 ve 1.0 mL Milli-Q su ekleyin ve aralıklı çalkalama ile bir su banyosunda 30 dakika boyunca karanlıkta 40 ° C'de inkübe edin.
- Süspansiyonu 5.300 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.
- Parçacık içermeyen bir boşluk hazırlayın.
- Süpernatanın 3,5 mL'sini 10 mm'lik bir kuvars küvete aktarın ve görünür bölgedeki bir UV/Vis spektrofotometresinde boşluğa karşı 760 nm'de absorbansı ölçün.
- 5.3.1-5.3.5 adımlarını izleyerek standart gallik asidin bir kalibrasyon eğrisini hazırlayın; sadece 200 μL lignin partikül süspansiyonu yerine, başlangıç konsantrasyonları 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ve 200 μg/mL olan etanolik gallik asit çözeltisini kullanın.
- Mikropartiküllerin deneysel verilerini, kuru numunenin gramı başına miligram (mg GAE/g) cinsinden mg gallik asit eşdeğeri olarak ifade edin.
- Denklem (5) kullanarak TPC'yi hesaplayın:
mg GAE/g (5)
CGA , asidin kalibrasyon grafiğinden (μg GA/mL) elde edilen standart gallik asit konsantrasyonuna eşdeğer numune konsantrasyonudur; CS, kuru numune kütlesinin çözücünün hacmine (μg/mL) bölünmesine eşit olan numunenin konsantrasyonudur.
, MGEQ/G (3)
MGEQ/G (4)
mg GAE/g (5)6. Lignin partiküllerinin in vitro salım kapasitesinin belirlenmesi
- Standart PBS çözeltisinin pH'ını 0.1 M HCl ile pH = 1.2'ye ayarlayarak 250 mL simüle edilmiş enzim içermeyen mide ortamı hazırlayın.
- Standart PBS çözeltisinin pH'ını 0.1 M NaOH / 0.1 M HCl ile sırasıyla pH = 6.8 ve 7.4'e ayarlayarak simüle edilmiş iki bağırsak sıvısı çözeltisinin her birinden 250 mL hazırlayın.
- Mekanik bir karıştırıcı ile donatılmış bir cam kesikli reaktörde simüle edilmiş enzim içermeyen mide ortamının 50 mL'sine 25 mg flavonoid kapsüllü mikro-/mikron altı partikül ekleyin ve T = 37 ± 0.2 oC sabit bir sıcaklıkta bir termal su banyosuna yerleştirin.
- Katı ve sıvı fazların tam olarak karışmasını sağlamak ve durgun bölgeler olmadan maksimum kütle transferini sağlamak için karıştırıcıyı sıvı hacminin 2/3'ü kadar bir derinliğe daldırın.
- 90. dakikaya kadar her 10 dakikada bir reaktörden 1 mL numune alın ve toplam hacmin değişmesini önlemek ve lavabo koşullarını sağlamak için hemen 1 mL taze simüle edilmiş sıvı çözeltisini reaktöre pipetleyin.
- 6.3-6.6 adımlarını içeren aynı prosedürü, sırasıyla pH = 6.8 ve 7.4 olan simüle edilmiş bağırsak sıvısı çözeltileri ile 200 dakika boyunca tekrarlayın.
- Simüle edilmiş üç ortamda yüksüz lignin parçacıkları ile benzer deneyler yapın ve numuneleri spektrofotometreyi sıfırlamak için boşluklar olarak kullanın.
- Numuneleri filtreledikten ve adım 6.7'deki boş numunelere karşı %96 EtOH ile seyrelttikten sonra numunelerin absorpsiyonunu spektrofotometrik olarak belirleyin ve sırasıyla pH = 1.2, 6.8 ve 7.4'te elde edilen morinin karşılık gelen kalibrasyon eğrilerini kullanarak karşılık gelen flavonoid konsantrasyonunu hesaplayın.
- μg/mL cinsinden denklem (6) kullanarak biyoflavonoidlerin kümülatif salınımını (CR) ve denklem (7) ile kümülatif salım yüzdesini (CRP) hesaplayın:
(6)
Burada Ci ve Ci+1 , iinci ve (i+1)inci numunelerdeki (μg/mL) morin/quercetin konsantrasyonlarıdır; Kesikli reaktörden alınan numune hacmi (mL); V Simüle edilmiş ortamın toplam hacmi (mL).
(7)
BuradaC maks , taşıyıcıdaki biyolojik olarak aktif bileşiğin maksimum konsantrasyonudur (μg/mL).
(6)
(7)7. İstatistiksel analizler
- Deneysel verileri, üç bağımsız ölçümün standart sapmaları (SD) ± ortalamaları olarak ifade edin.
- ANOVA testini post hoc test olarak gerçekleştirerek deneysel sonuçların istatistiksel anlamlılığını belirleyin. İstatistiksel olarak anlamlı bir p < 0.05 değerini düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alkali lignin mikro-/mikron altı parçacıkları üretmek için bir anti-solvent çökeltme tekniği uygulandı. Seyreltilmiş inorganik asit-nitrik asit/organik asit-sitrik asitten oluşan sulu bir çözelti, çevre dostu bir yüzey aktif madde/etanol ile zenginleştirilmiş bir alkali lignin sulu çözeltisine dağıtıldı, bu da biyopolimer çözünen maddenin kademeli olarak çökelmesine neden oldu ve sonikasyondan sonra, kompakt mikro-/mikron altı parçacıkların bir süspansiyonu nihayet üretildi (Şekil 1).
Şekil 1: Lignin partiküllerinin homojenizasyonu. (A) Sentezlenen lignin mikron altı partiküllerinin ultrasonik homojenizasyonu; (B) Homojenize morin yüklü ve yüksüz lignin mikropartikülleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Yüksüz ve morin kapsüllü lignin mikrotaşıyıcılarının boyut, sayı ve boyut dağılımı belirlendi (Şekil 2). Deneysel veriler, biyoflavonoid yüklü mikro taşıyıcıların (Şekil 2B) 7.4 × 106 partikül / mL (1.474 partikül / μL) konsantrasyonuna ve ortalama 5.7 μm boyuta sahip yük×süzlere göre daha yüksek konsantrasyon, 107 partikül / mL (2.037 partikül / μL) ve daha yüksek ortalama boyut, 6.1 μm olduğunu kanıtladı (Şekil 2A). 3-6 μm boyut aralığındaki her iki partikül tipinin yüzde boyut dağılımı, yüksüzler için %75.2 ve morin kapsüllü mikro taşıyıcılar için %69.3 ve 7-10 μm aralığında sırasıyla %20.2 ve %25.2 idi. Antisolvent olan nitrik asidin miktarı, konsantrasyonu ve akış hızı, partiküllerin boyutu için gereklidir. Daha yüksek konsantrasyon ve daha fazla asit miktarı daha büyük partiküllere yol açarken, daha yüksek akış hızı süspansiyonun toplanmasına neden olur.
Şekil 2: Parçacık boyutu dağılımı. (A) Parçacık sayacının 1 μL süspansiyon yazılımında yüksüz lignin mikropartiküllerinin gerçek boyut dağılımı; (B) partikül sayacının 1 μL süspansiyon yazılımında morin kapsüllü alkali lignin mikropartiküllerinin gerçek boyut dağılımı. (C) Yüksüz lignin mikropartiküllerinin dağılımının partikül sayacı mikroskobik fotoğrafı; (D) morin kapsüllü alkali lignin mikropartiküllerinin dağılımının partikül sayacı mikroskobik fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3, etanol morin çözeltilerinin, alkali lignin sulu çözeltilerinin ve farklı başlangıç konsantrasyonlarına sahip morin ve lignin içeren karışımların UV/Vis absorpsiyon spektrumlarını göstermektedir. Açıktır ki, saf lignin ve biyoflavonoidin absorpsiyon zirveleri çakışmaz ve heteropolimer, flavonoidin polimer mikro taşıyıcılara kapsüllenmesinden sonra sıvı fazdaki morin konsantrasyonunun belirlenmesi için uygulanan spektrofotometrik yöntem sırasında ve in vitro salım deneyleri sırasında herhangi bir bozucu etki göstermez. İki bileşenli karışımdaki morinin maksimum emilimi, alkali lignin varlığına bağlı olarak ortamın artan pH'ının bir sonucu olarak, λmax = 359 nm'den λmax = 395 nm'ye daha yüksek bir dalga boyuna kaymıştır. Görünür alandaki absorpsiyon maksimumunun ikinci sapması, ortamın çeşitli pH değerlerinde morinin kalibrasyon eğrilerinin tasarımı gerekliliğini ortaya çıkarmıştır (Şekil 4A). Çok güçlü doğrusal korelasyonlarla karakterize edilen üç standart eğri, morin konsantrasyon aralığı Co = 2.5-100 μg / mL içindeki regresyon katsayılarının (R2 > 0.99) yüksek değerleri ile kanıtlanmıştır. Benzer şekilde, Şekil 4B'de sunulan üç simüle edilmiş fizyolojik bölmedeki üç standart quercetin eğrisi, aynı konsantrasyon aralığında yüksek doğrusallık gösterdi.
Şekil 3: Morin, alkali lignin sulu çözeltilerinin etanolik çözeltilerinin ve farklı başlangıç konsantrasyonlarına sahip morin ve lignin içeren karışımların UV/Vis spektrumlarının karşılaştırılması. Saf lignin ve morinin spektrumları çakışmaz ve heteropolimer herhangi bir yıkıcı etki göstermez. Morine lignin eklenmesi, morinin maksimum emiliminin λmaks = 359 nm'den λmaks = 395 nm'ye daha yüksek bir dalga boyuna kaymasına yol açar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Etanolik flavonoid çözeltilerinin kalibrasyon eğrileri. (A) Morin ve (B) quercetin, pH = 1.2 (mavi) (simüle edilmiş mide sıvısına karşılık gelir), pH = 6.8 (kırmızı) (simüle edilmiş ince bağırsak sıvısına karşılık gelir) ve pH = 7.4 (yeşil) (simüle edilmiş kolon sıvısına karşılık gelir) Co = 2.5-100 μg / mL konsantrasyon aralığında olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Yüksüz ve yüklü alkali lignin partiküllerinin yüzeyindeki asidik ve bazik aktif bölgelerin/fonksiyonel grupların nispi konsantrasyonu, potansiyometrik titrasyon ile belirlendi. Hesaplamalar, ikinci türev diferansiyel titrasyon eğrileri tarafından belirlenen eşdeğer titrasyon çözeltisi hacimlerine dayanmaktadır (Şekil 5). Belirlenen pKa'nın değerleri, asidik (güçlü, zayıf, toplam) fonksiyonel grupların konsantrasyonları ve mikro ve mikron altı partiküllerin pH ve pHpzc'leri Tablo 1'de sunulmaktadır.
Şekil 5: Yüksüz ve yüklü lignin mikro-/mikron altı parçacıklarının ikinci türev diferansiyel potansiyometrik titrasyon eğrileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Parametre | lignin mikropartikülleri | Morin kapsüllü lignin mikropartikülleri | Lignin mikron altı parçacıkları | Quercetin kapsüllenmiş lignin mikron altı parçacıkları |
| Veşdeğeri, mL | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa (İngilizce) | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (güçlü), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (zayıf), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (toplam), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (sulu süspansiyon) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pHpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
Tablo 1: Titrantın eşdeğer hacminin (Veq) değerleri, asit ayrışma sabitinin negatif baz -10 logaritması (pKa), asidik (güçlü, zayıf, toplam) fonksiyonel grupların konsantrasyonları (Aa, mgeq/g), pH ve yüksüz ve yüklü lignin mikro ve mikron altı partiküllerin sıfır yük noktası (pHpzc). Mikro ve mikron altı, yüksüz ve flavonoid yüklü lignin parçacıkları, pH'larıpzc > negatif yüklüdür.
Modifiye edilmiş bir Folin-Ciocalteu kolorimetrik yöntemi ile belirlenen ve gallik asit eşdeğerleri olarak hesaplanan toplam fenolik içerik (TPC), yüksüz lignin partiküllerinin 78.2 mg GAE/g iken, aynı konsantrasyona sahip morin kapsüllenmiş mikro taşıyıcıların TPC değeri 2.3 kat daha yüksekti (183.43 mg GAE/g). Sonuncusu, hetero biyopolimer parçacıklarının, flavonoid moleküllerinin dahil edilmesi nedeniyle ek fenolik gruplarla zenginleştirildiğini gösterir. Flavonoid kapsülleme etkinliği morin için% 98.1 ve quercetin için% 97.6 idi. İlaç kapsülleme kapasiteleri morin yüklü mikropartiküller için %28.2 ve kersetin enkapsüle edilmiş mikron altı partiküller için %39.0 idi.
Morin ve quercetin'in in vitro kümülatif salınımı, simüle edilmiş gastrointestinal enzim içermeyen ortamlarda araştırıldı: sırasıyla pH = 1.2, 6.8 ve 7.4'te mide, ince bağırsak ve kolon sıvıları (Şekil 6). Yaklaşık% 24'lük en yüksek salım verimliliği, pH = 6.8'de 30-40 dakika sonra elde edildi. Deneysel sonuçlara göre, simüle edilmiş ince bağırsak ortamında salınan flavonoidin miktarı, simüle edilmiş kolon ortamında salınan flavonoidin iki katı ve midede belirlenen salım verimliliğinin üç katı galip geldi. 70. - 90. dakikada pH = 7.4'te SIF'de kurulan en yüksek quercetin salınımı derecesi %34 idi, bu da SGF'de (pH = 1.2) ve SIF'de (pH = 6.8) flavonoidin kümülatif salınımını aştı %23.5 ve %18, saygıyla.
Şekil 6: Simüle edilmiş fizyolojik ortamlarda lignin mikro ve mikron altı partiküllerden morin ve quercetin'in kümülatif in vitro salım verimliliğinin karşılaştırmalı analizleri. Morin salınımının en yüksek derecesi, simüle edilmiş ince bağırsak ortamında elde edildi. Quercetin'in en yüksek salım verimliliği, simüle edilmiş kolon sıvısında kaydedildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biyopolimerlere dayalı ilaç taşıyıcı formülasyonların tasarımı için modern sentez metodolojilerinin ana kritik konuları arasında, tehlikeli organik reaktiflerin - tetrahidrofuran, aseton, metanol ve hatta yüksek konsantrasyonlarda DMSO gibi uçucu ve yanıcı çözücülerin - olası toksik etkilerin tezahürü nedeniyle biyotıp, ilaç endüstrisi ve gıda teknolojisinde uygulanabilirliklerini sınırlayan uygulamalar yer almaktadır20, 21,22,23,24. Bir diğer önemli nokta, sentez prosedürü sırasında karmaşık kimyasal reaksiyonların (örneğin, esterleştirme, polimerizasyon) veya pahalı aparatların dahil edilmesidir. Bu el yazmasında sunulan her iki teknik de, alternatif çözücülerin (su) ve yüzey aktif maddeler (Tween 80) ve çapraz bağlama maddeleri (etanol, sitrik asit) gibi toksik olmayan bileşiklerin uygulanmasıyla ikinci sınırlamaların üstesinden gelmekte ve bunları "yeşil" sentez yöntemleri olarak sınıflandırmaktadır. Ayrıca, metodolojiler, fizyolojik olarak aktif maddelerin biyolojik olarak parçalanabilir, biyoaktif ve biyouyumlu taşıyıcı şablonları olarak hizmet eden, lignin parçacıklarının tasarımı için ucuz, çevre dostu, sürdürülebilir prosedürlerin geliştirilmesi için kritik gerekliliği ve dürtüyü karşılayan bir çözüm sunmaktadır25.
İstenilen büyüklükte lignin partikülleri elde etmek için iki üretim koşulu seçildi: biri yüksek lignin konsantrasyonu (50 g/L) ve bir anti-çözücü ajan olarak nitrik asit ve diğeri daha düşük lignin konsantrasyonu (5 g/L), bir anti-çözücü olarak etanol ve sitrik asit, lignin partiküllerinin boyutunu etkileyen iki değişken olduğundan, aynı anda hem antisolvent hem de çapraz bağlama ajanının ikili rolünü oynar. Her iki prosedür sırasında da akış hızı, daha küçük parçacıklar sağlamak ve toplanmalarını önlemek için düşük tutuldu. Sentez protokolleri için inorganik ve organik asitlerin seçimi ile ilgili olarak dikkate alınması gereken bazı kritik noktalar vardır.
Nitrik asit, yüksek oranda alkali lignin çökelmesini sağlayan güçlü bir inorganik asit olduğu ve ilave oranlarını kontrol ederek istenen boyut aralığında partiküller elde edilebildiği için seçilmiştir. Ayrıca,HNO3 ilavesinin, aşağıdakilerle ilişkili lignin yapısındaki olası kimyasal değişiklikler nedeniyle heteropolimer partiküllerin modifikasyonunu sağlayabileceği beklenmektedir: -NO2 grupları ile benzen halkalarındaki H-atomlarının nitrasyon-ikame reaksiyonlarının süreçleri; alifatik -OH gruplarının esterleşmesi ve ester fonksiyonel gruplarının oluşumu; ve/veya fenolik -OH ve -OCH3 gruplarının oksidasyonu kinon yapılarının oluşumuna neden olur. Sentezlenen parçacıkların boyutu için çökeltici ve lignin konsantrasyonunun rolü ile ilgili olarak, bir yandan, güçlü nitrik asit (pKa = -1.4) ilavesi ile birlikte daha yüksek başlangıç lignin konsantrasyonu ve alkali heteropolimerin inorganik asit içindeki sınırlı çözünürlüğü, mikrometre aralığında parçacıkların üretilmesine yol açmıştır. Öte yandan, daha düşük konsantrasyonlu sulu alkali lignin çözeltisine etanol ilavesi, alkali ligninin alkoldeki kısmi çözünürlüğü nedeniyle ince bir süspansiyon oluşumuna neden olur. Ayrıca, müteakip sitrik asit ilavesi, organik asidin nitrik asitten daha zayıf olması (pKa1 = 3.13) ve sonuç olarak daha düşük çökelme uzaması nedeniyle nanometre aralığında parçacıkların üretilmesine yol açmıştır.
Nano boyutlu farmasötiklerin bazı temel özellikleri, ilaç dolaşımı, belirli bölgelerde dozaj formlarından ilaç salımı ve biyolojik membranlar yoluyla emilimdir. Bu özellikler, nanopartikül taşıyıcılarının bazı fiziksel ve kimyasal özelliklerinden ve kapsüllenmiş ilaç moleküllerinden önemli ölçüde etkilenir.
Biyopolimer taşıyıcıların fizikokimyasal özellikleri: yüzey aktif asidik ve bazik grupların konsantrasyonu, sıfır yük noktası (pHPZC), boyut, partikül boyutu dağılımı ve ayrıca biyoaktif maddenin dahil edilmesinden önce ve sonra partiküllerin spektral özellikleri, fonksiyonel grupları değerlendirirken dikkate alınması gereken temel parametrelerdir, reaktivite, parçacıkların kararlılığı ve homojenliği10.
Parçacık boyutu, parçacık boyutu dağılımı, yük ve morfoloji bu değerlendirmeleri etkileyen başlıca faktörler arasındadır. Partikül boyutu, stabilitelerini, reaktivitelerini ve ilaç salım davranışlarını etkiler26. Daha küçük parçacıklar daha büyük bir kütle transfer alanı sunar ve bu da daha yüksek bir ilaç salım oranına yol açar. Buna karşılık, daha büyük parçacıkların daha küçük kütle transfer yüzey alanı, bu parçacıkların içinde daha düşük bir ilaç difüzyon hızı ile sonuçlanır.
Katı yüzeylerde bulunan asidik ve bazik bölgelerin ve fonksiyonel grupların belirlenmesi için temel teknikler olarak titrimetrik yöntemlerin uygulanması sürekli genişlemektedir. Potansiyometrik titrasyonun başlıca avantajları arasında zamandan ve iş gücünden tasarruf, yüksek hassasiyet ve referans standartların ve pahalı cihazların ortadan kaldırılması yer alır. Bu çalışmada yöntem, yüklü ve yüksüz biyopolimer taşıyıcıların yüzeyinde bulunan aktif bölgelerin doğasının ve sayısının kalitatif ve yarı kantitatif olarak belirlenmesi yoluyla biyopolimer partiküllerinin karakterizasyonuna izin verdiği için uygulanmıştır27.
Biyolojik ve tıbbi mikro-/nano- taşıyıcıların yüzey yükü, hücresel alımda önemli bir rol oynar28. pHPZC , sıfır yüzey yük yoğunluğuna, yani proton dengesi tarafından geliştirilen eşdeğer miktarlarda negatif ve pozitif yüklere karşılık gelir. Bu değerlerin belirlenmesi, adsorpsiyonun özgüllüğü hakkında bilgi sağlar29. Bununla birlikte, parametre izoelektrik noktası sadece süspansiyondaki partiküllerin dış yüzey yüklerini temsil ettiğinden, sıfır yük noktası partiküllerin toplam net yüzey yüküne (dış ve iç) yanıt olarak değişirken, pHpzc protokolü bu çalışmada ilk kez biyopolimer ilaç taşıyıcılarının karakterizasyonu için basit ve etkili bir yöntem olarak uygulanmıştır. pHpzc kavramına göre, pHpzc'nin üzerindeki pH'da, biyopolimer partiküllerinin yüzeyi ağırlıklı olarak negatif yüklüyken, süspansiyonun pH'ı pHpzc'nin altında olduğunda net bir pozitif yük gözlenir. Tablo 1'de sunulan deneysel verilerden, mikro ve mikron altı, yüksüz ve flavonoid yüklü lignin parçacıklarının, pH'larıpH pzc > nedeniyle negatif yüklü olduğu sonucuna varılabilir.
Flavonoid yüklemesinin verimliliği, kapsülleme verimliliği ve ilaç yükleme kapasitesinden etkilenir. Kapsülleme etkinliği (E, %) partiküllere dahil edilen ilaç miktarının formülasyondaki toplam miktara oranı olarak tanımlanır. Kapsülleme verimliliği, ilaç özelliklerinden, çözücüden ve taşıyıcıdanetkilenir 30.
Bununla birlikte, fizyolojik olarak aktif bir maddenin verimli bir şekilde verilmesi, moleküllerinin taşıyıcı matristen salınma şekline ve derecesine bağlıdır. Bu nedenle, ilaç salım mekanizmasını vesalım oranını 31,32,33 dikkate almak çok önemlidir. Biyoflavonoidlerin biyopolimerik mikro / nano taşıyıcılarından in vitro salım mekanizmasını açıklayarak, flavonoidin ve taşıyıcının gerçek bir fizyolojik ortamdaki davranışını simüle edebilir ve tahmin edebilir ve geliştirilmiş biyoyararlanıma sahip farmasötik formülasyonların tasarımını optimize edebilir. Bu çalışmada elde edilen deneysel in vitro sonuçlar, mide ortamındaki lignin submikron ve mikro partiküllerden morin/quercetin salınımının daha düşük olması nedeniyle, yenilikçi biyopolimer partiküllerinin, biyoaktif maddelerin doğrudan oral yoldan verilmesine kıyasla daha düşük mide tahrişi riski nedeniyle oral uygulama için uygun olduğunu kanıtladıkları için klinik uygulama için yararlıdır. Yenilikçi biyopolimer mikropartiküller, biyoaktif maddelerin doğrudan oral yoldan uygulanmasına kıyasla daha düşük mide tahrişi riski nedeniyle oral uygulama için uygundur. Ayrıca, mikron altı partiküller, küçük boyutları ve önemli salım potansiyelleri nedeniyle, enjekte edilebilir formülasyonlar olarak uygulanabilir. Ek olarak, yeni lignin mikro ve mikron altı taşıyıcılar, bağırsak sisteminde doymuş çözeltiler oluşturma eğilimlerinden kaynaklanan, belirli biyoflavonoidlerin yüksek dozlarının oral yoldan verilmesiyle ilgili zorluklarla ilgili diğer bilim adamları tarafından bildirilen sınırlamaların üstesinden gelme fırsatı sunar, bu da çözünme sürecini ve verimli rezorpsiyonlarını engeller.
Sentez kolaylığı, elde edilen parçacıkların biyouyumluluğu ve mevcut protokolün özelleştirilmesi olasılığı, sunulan metodolojinin başlıca avantajlarını temsil eder. Partiküllerin boyutu, amaçlanan uygulamaları için en uygunudur, terapötiklerin ekleri ve hedefleme kısımları için yeterli yüzey alanı sunar, bu da hedef dozaj gereksinimlerine ulaşmak için daha fazla partikülün uygulanmasını gerektirmez. Yenilikçi parçacıkların sentezi için temel heteropolimer matris olarak ligninin kullanılması, artan biyouyumluluğa izin verir ve parçacıkların çeşitli uygulamalar için özelleştirilmesi için fırsatlar sunan çeşitli aktif fonksiyonel gruplar sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, KΠ-06 H59/3 Sözleşme No'lu Bulgaristan Bilim Fonu ve Trakya Üniversitesi 07/2023 FVM Bilimsel Proje No'lu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
References
- Yu, X., et al. Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics. ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).
- Boarino, A., Klok, H. -A. Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications. Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).
- Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging. Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).
- Sharma, S., et al. Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application. Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041 (2022).
- Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T.
- Beaucamp, A., et al. Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review). Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).
- Antunes, F., et al. From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application. Int J Biol Macromol. 234, 123592 (2023).
- Garg, J., et al. Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update. Materials Letters. 311, 131573 (2022).
- Anushikha, K. K. Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications. Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).
- Freitas, F. M. C., et al. synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment. Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).
- Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus. Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070 (2020).
- Worku, L. A., et al. Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application. Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793 (2023).
- Gala Morena, A., Tzanov, T. z Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials. Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).
- Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative. Int J Mol Sci. 24 (16), 12705 (2023).
- Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity. Pharmaceutics. 15 (4), 1067 (2023).
- Yaneva, Z., et al. Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity. Antibiotics. 11, 650 (2022).
- Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications. Polymers. 15 (6), 1487 (2023).
- Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).
- Tang, Q., et al. Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications. Polymers. 12 (11), Basel. 2471 (2020).
- Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin. Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).
- Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate. Food Res Int. 66, 93-99 (2014).
- Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. Lignin from micro- to nanosize: Applications. Int. J. Mol. Sci. 18, 2367 (2017).
- Mishra, P. K., Ekielski, A. A simple method to synthesize lignin nanoparticles. Colloids Interfaces. 3, 52 (2019).
- Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor. Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).
- Tardy, B. L., et al. Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules. Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).
- Silva, M., et al. Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies. J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).
- Georgieva, N., Yaneva, Z. Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study. Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).
- Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. Charge reversal nano-systems for tumor therapy. J Nanobiotechnol. 20, 31 (2022).
- Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).
- Zatorska, M., et al. Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study. Int J Pharmaceutics. 591, 120031 (2020).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).
- Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass. Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).
