الطبقات أجار تصاعد: إعداد الأجنة حمار وحشي لايف للتصوير على المدى الطويل مع المجهر مقلوب

Overview

توضح هذه المقالة طريقة لتركيب أجنة حمار وحشي حية للتصوير على المدى الطويل. هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة وسهلة الأداء باستخدام الأطباق المجهرية العادية ذات القاع الزجاجي للتصوير على المجهر المقلوب. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من الآغاروز بتركيزات مختلفة.

Protocol

1. إعداد الأجنة

1. بعد التزاوج، حصاد الأجنة في E3 في طبق بيتري واحتضانها في 26.5 درجة مئوية لحوالي 28 ساعة قبل تصاعد.
   ملاحظة: وهذا يبطئ تطور الأجنة بحيث تكون الأجنة في مرحلة 30 سوميت تقريبا في بداية التصوير.
2. تخدير الأجنة في 0.016-0.020٪ Tricaine في E3. لتثبيط التصبغ، أضف وحدة الإرسال الكبرى إلى تركيز 200 ميكرومتر.
3. dechorionate الأجنة باستخدام ملقط تحت المجهر تشريح. باستخدام اثنين من ملقط، قبضة وسحب بلطف المشيمة وبصرف النظر للافراج عن الجنين.

2. تصاعد في أغاروز

ملاحظة: تتطلب طريقة التركيب المتقدمة تركيزين مختلفين من الآغاروز منخفض الذوبان في E3 مع 0.02٪ Tricaine و PTU حسب الحاجة. يحتوي محلول الآغاروز الأول على تركيز أمثل للأغاروز يكون فيه التشويه والحركة في الحد الأدنى. يتم وصف التحسين في الخطوة 5 أدناه.

1. سخني حلول الآغاروز للطبقتين (التركيز المحدد في الخطوة 5 أدناه و1٪) إلى 65 درجة مئوية دع الآجروز يبرد إلى حوالي 30 درجة مئوية قبل التركيب مباشرة حتى لا يتضرر الجنين من الحرارة. للتركيب، استخدم أطباق القاع الزجاجي مقاس 35 مم مع قاع زجاجي للتغطية رقم 0. الزجاج الغطاء تعلق على الجزء السفلي من الطبق يخلق 10 ملم الضحلة (حوالي 1.2 ملم عميق) جيدا، والتي يتم وضعها الجنين.
   ملاحظة: في هذه الحالة، كان التركيز مع أقل حركة والتشوهات بين 0.025 إلى 0.040٪ agarose.
2. ضع بلطف جنينا مهترأ مع أحد جوانبه الجانبية نحو الجزء السفلي من الطبق باستخدام ماصة زجاجية أو ميكروبايت. إذا كنت تستخدم micropipette، وقطع الجزء الخارجي من طرف لزيادة حجم الفتحة لتناسب الجنين (الشكل 1A). إزالة بعناية أي E3 المتبقية مع micropipette.
3. إضافة أول حل agarose إلى البئر الصغيرة التي تم إنشاؤها بواسطة الزجاج غطاء تعلق على الجزء السفلي من الطبق لتغطية الجنين (طبقة 1) (الشكل 1B). تأكد من أن أغاروز يغطي البئر الصغيرة ولكن لن يفيض عليه.
4. تغطية البئر الصغيرة مع غطاء الزجاج (22 ملم × 22 ملم) (الشكل 1C) لخلق ضيق agarose شغل الفضاء مع الجنين بين النظارات غطاء اثنين.
5. وضع طبقة من محلول agarose 1٪ على رأس الزجاج الغطاء في جميع أنحاء الجزء السفلي من الطبق (طبقة 2) (الشكل 1D). كما يتماسك هذه الطبقة، فإنه يحمل الزجاج الغطاء في مكان.
6. ملء الجزء المتبقي من الطبق مع E3 تحتوي على 0.02٪ Tricaine للحفاظ على النظام رطب (طبقة 3) (الشكل 1E).
   ملاحظة: في هذا الإعداد، والزجاج غطاء و 1٪ agarose حماية الطبقة السفلية من الحصول على المخفف.

3. الأمثل للحل agarose للطبقة 1

1. لتحديد التركيز الأمثل للأغاروز للطبقة 1، استخدم نهج بحث الشبكة متعدد المقاييس. جبل الأجنة في تركيزات متزايدة من الآجروز تتراوح بين 0.01٪ إلى 1٪ تليها التصوير الفاصل الزمني للحد من نمو الجنين والحركة في مجال الرؤية. تحديد التركيزات حيث يكون كل من التشويه والحركة في الحد الأدنى.
2. لتحسين تركيز الآجروز بشكل أكبر، قم بتركيب الأجنة باستخدام مجموعة أدق من تركيزات الآجروز (على سبيل المثال، بين 0.025 و0.040٪ agarose) اعتمادا على التركيز الذي وجد أنه الأفضل في الخطوة 3.1 (على سبيل المثال، 0.025٪، 0.028٪، 0.031٪، إلخ).
   ملاحظة: في مختبرنا، كان تركيز الآغاروز الأمثل حوالي 0.03٪.

Representative Results

الشكل 1 : وصف طريقة التركيب. (أ) إضافة جنين حمار وحشي إلى البئر الصغيرة التي تم إنشاؤها بواسطة القاع الزجاجي في طبق 35 ملم. (ب) إضافة طبقة الآغاروز 1 إلى البئر الصغيرة لتغطية الجنين. (ج) وضع بعناية غطاء الزجاج على البئر الصغيرة. (د) إضافة طبقة agarose 2 على الجزء السفلي كله من طبق 35 ملم. (ه) إضافة E3 إلى الطبق. (F) رسم تخطيطي لقسم عرضي من إعداد التركيب. (G) صورة المجهر (الهدف 5x) من جنين حمار وحشي في المونتاج النهائي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067