Montage de l’agar en couches : Préparation d’embryons vivants de poisson zèbre pour l’imagerie à long terme au microscope inversé

Overview

Cet article décrit une méthode pour monter des embryons vivants de poisson zèbre pour l’imagerie à long terme. Cette méthode est rentable et facile à utiliser en utilisant des microscopies régulières à fond de verre pour l’imagerie au microscope inversé. Le montage est effectué en couches d’agarose à différentes concentrations.

Protocol

1. Préparation d’embryons

1. Après l’accouplement, récolter les embryons en E3 dans une boîte de Pétri et les incuber à 26,5 °C pendant environ 28 h avant de monter.
   REMARQUE: Cela ralentit le développement des embryons de sorte que les embryons sont d’environ 30 stade somite au début de l’imagerie.
2. Anesthésier les embryons en 0,016-0,020% Tricaine à l’E3. Pour inhiber la pigmentation, ajouter la PTU à une concentration de 200 μM.
3. Déchorionner les embryons à l’aide de forceps sous un microscope disséquant. À l’aide de deux forceps, saisir et tirer doucement le chorion à part pour libérer l’embryon.

2. Montage en agarose

REMARQUE: La méthode de montage développée nécessite deux concentrations différentes d’agarose à faible fonte à l’E3 avec 0,02% de Tricaine et de PTU au besoin. La première solution d’agarose contient une concentration optimale d’agarose à laquelle la distorsion et la motilité sont au minimum. L’optimisation est décrite à l’étape 5 ci-dessous.

1. Chauffer les solutions d’agarose pour les deux couches (concentration définie à l’étape 5 ci-dessous et 1%) à 65 °C. Laisser refroidir l’agarose à environ 30 °C juste avant le montage afin que l’embryon ne soit pas blessé par la chaleur. Pour le montage, utilisez des plats de fond en verre de 35 mm avec un fond en verre de couverture n° 0. Le verre de couverture fixé au fond du plat crée un puits peu profond de 10 mm (environ 1,2 mm de profondeur), dans lequel l’embryon doit être placé.
   REMARQUE: Dans ce cas, la concentration avec le moins de motilité et de distorsions se situe entre 0,025 et 0,040 %.
2. Placer délicatement un embryon déchorionné avec l’un de ses côtés latéraux vers le fond du plat à l’aide d’une pipette en verre ou d’une micropipette. Si vous utilisez une micropipette, coupez la partie externe de la pointe pour augmenter la taille de l’ouverture pour s’adapter à l’embryon (Figure 1A). Retirer délicatement le reste de l’E3 à l’aide d’une micropipette.
3. Ajouter la première solution d’agarose au petit puits créé par le verre de couverture fixé au fond du plat pour couvrir l’embryon (couche 1) (figure 1B). Assurez-vous que l’agarose couvre le petit puits, mais ne le débordera pas.
4. Couvrir le petit puits d’un verre de couverture (22 mm x 22 mm)(figure 1C)pour créer un espace étroit rempli d’agarose avec l’embryon entre les deux verres de couverture.
5. Placez une couche de solution d’agarose de 1 % sur le dessus du verre de couverture sur tout le fond du plat (couche 2) (figure 1D). Au fur et à mesure que cette couche se solidifie, elle maintient le verre de couverture en place.
6. Remplissez la partie restante du plat d’E3 contenant 0,02 % de Tricaine pour garder le système hydraté (couche 3) (figure 1E).
   REMARQUE: Dans cette configuration, le verre de couverture et 1% agarose protègent la couche inférieure de se diluer.

3. Optimisation de la solution agarose pour la couche 1

1. Pour identifier la concentration optimale d’agarose pour la couche 1, utilisez une approche de recherche de grille à plusieurs échelles. Monter les embryons dans des concentrations croissantes d’agarose allant de 0,01% à 1%, suivi d’une imagerie en accéléré de la restriction de croissance de l’embryon et de la motilité dans le domaine de la vue. Identifiez les concentrations où la distorsion et la motilité sont au minimum.
2. Afin d’optimiser davantage la concentration d’agarose, monter les embryons à l’aide d’une gamme plus fine de concentrations d’agarose (p. ex., entre 0,025 et 0,040 % d’agarose) selon la concentration jugée la meilleure à l’étape 3.1 (p. ex., 0,025 %, 0,028 %, 0,031 %, etc.).
   REMARQUE: Dans notre laboratoire, la concentration optimale d’agarose était d’environ 0,03%.

Representative Results

Figure 1 : Description de la méthode de montage. (A) Ajouter l’embryon de poisson zèbre au petit puits créé par le fond de verre dans le plat de 35 mm. (B) Ajouter la couche d’agarose 1 au petit puits pour couvrir l’embryon. (C) Placer délicatement un verre de couverture sur le petit puits. (D) Ajouter la couche d’agarose 2 sur tout le fond du plat de 35 mm. (E) Ajouter l’E3 au plat. (F) Dessin schématique d’une section transversale du montage mis en place. (G) Image au microscope (objectif 5x) de l’embryon de poisson zèbre dans le montage final.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067