Overview
В этой статье описывается метод установки живых эмбрионов зебры для долгосрочной визуализации. Этот метод является экономически эффективным и простым в использовании регулярных стеклянно-нижней микроскопии посуды для визуализации на перевернутый микроскоп. Монтаж выполняется слоями агарозы в различных концентрациях.
Protocol
1. Подготовка эмбрионов
- После спаривания, урожай эмбрионов в E3 в чашке Петри и инкубировать их при 26,5 градусов по Цельсию около 28 ч до монтажа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это замедляет развитие эмбрионов, так что эмбрионы находятся примерно на 30 стадиях сомита в начале изображения. - Анестезия эмбрионов в 0.016-0.020% Tricaine в E3. Чтобы ингибировать пигментацию, добавьте ПТУ к концентрации 200 МКМ.
- Дехорионат эмбрионов с помощью хлипов под рассеченным микроскопом. Используя два типса, сцепление и осторожно тянуть хорион друг от друга, чтобы освободить эмбрион.
2. Монтаж в агарозе
ПРИМЕЧАНИЕ: Разработанный метод монтажа требует двух различных концентраций низкорастуающей агарозы в E3 с 0,02% Tricaine и PTU по мере необходимости. Первый раствор агарозы содержит оптимальную концентрацию агарозы, при которой искажение и подвижность являются минимальными. Оптимизация описана в шаге 5 ниже.
- Нагрейте агарозные растворы для двух слоев (концентрация, определяемая в шаге 5 ниже и 1%) до 65 градусов по Цельсию. Пусть агароза остынет примерно до 30 градусов по Цельсию перед монтажом, чтобы эмбрион не пострадал от жары. Для монтажа используйте 35 мм стеклянные нижние блюда с крышкой No 0. Крышка стекла прилагается к нижней части блюда создает 10 мм мелкой (около 1,2 мм глубиной) хорошо, в котором эмбрион должен быть помещен.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае концентрация с наименьшей подвижностью и искажениями составила от 0,025 до 0,040% агарозы. - Аккуратно поместите деторионированный эмбрион с одной из боковых сторон к нижней части блюда с помощью стеклянной пипетки или микропипетта. При использовании микропипета, вырезать внешнюю часть кончика, чтобы увеличить размер отверстия, чтобы соответствовать эмбриона(рисунок 1A). Аккуратно удалите оставшийся E3 с помощью микропипетта.
- Добавьте первый раствор агарозы в небольшой колодец, созданный крышкой стекла, прикрепленного к нижней части блюда, чтобы покрыть эмбрион (слой 1) (Рисунок 1B). Убедитесь, что агароза покрывает небольшой колодец, но не переполнит его.
- Обложка небольшой колодец с крышкой стекла (22 мм х 22 мм) (Рисунок 1C), чтобы создать узкую агарозу заполнены пространство с эмбрионом между двумя крышками очки.
- Поместите слой 1% агарозного раствора поверх крышки стекла по всей нижней части блюда (слой 2) (Рисунок 1D). Как этот слой затвердевает, он держит крышку стекла на месте.
- Заполните оставшуюся часть блюда СЕ3, содержащую 0,02% Tricaine, чтобы сохранить систему гидратированной (слой 3) (Рисунок 1E).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой установке, крышка стекла и 1% агарозы защитить нижний слой от разбавления.
3. Оптимизация раствора агарозы для слоя 1
- Для определения оптимальной концентрации агарозы для слоя 1 используйте многомасштабный подход к поиску сетки. Гора эмбрионов в увеличении концентрации агарозы в диапазоне от 0,01% до 1%, а затем замедленной визуализации ограничения роста эмбриона и подвижности в области зрения. Определите концентрации, где искажение и подвижность минимальны.
- Для дальнейшей оптимизации концентрации агарозы, смонтировать эмбрионы с использованием более тонкого диапазона концентраций агарозы (например, между 0,025 и 0,040% агарозы) в зависимости от концентрации оказались лучшими в шаге 3,1 (например, 0,025%, 0,028%, 0,031% и т.д.).
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории оптимальная концентрация агарозы составила около 0,03%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 : Описание метода монтажа. (A) Добавить эмбрион зебры к небольшой хорошо созданный стеклянным дном в 35 мм блюдо. (B) Добавить агарозный слой 1 к небольшой колодец, чтобы покрыть эмбрион. (C) Аккуратно поместите крышку стекла над небольшой колодец. (D) Добавить слой агарозы 2 на всем дне 35 мм блюдо. (E) Добавить E3 в блюдо. (F) Схематический рисунок поперечного сечения монтажа создан. (G) Микроскоп изображение (5x цель) эмбриона зебры в окончательном монтаже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 |