Streptozocin-Behandlung: Ein Zebrafisch-Modell des Typ-1-Diabetes Mellitus

Overview

Dieses Video beschreibt die Technik der Erstellung eines Zebrafischmodells für Typ-1-Diabetes mellitus mit Hilfe des Medikaments Streptozocin, um die Pathophysiologie diabetischer Komplikationen und des stoffwechselnden Gedächtnisses zu untersuchen.

Protocol

1. Generation Zebrafische mit Diabetes mellitus, DM Fisch

1. Bereiten Sie sowohl Erholung als auch Anästhesie-Wassertanks vor. Rückgewinnungswasser ist normales Fischwasser. Für Anästhetikum wasserfügen Sie ausreichend 2-Phenoxyethanol, so dass eine 1:1.000 Verdünnung in normalem Fischwasser erreicht wird.
2. Bereiten Sie eine 0,3%-Lösung (in einer Rauchhaube) von Streptozocin (STZ) vor, indem Sie 6 mg STZ zu 2 ml 0,09% Natriumchlorid hinzufügen und die Lösung sofort auf Eis legen. Dies wird genügend Injektionslösung für die Injektion von etwa 20 Fischen in 20 min bieten. Wenn Sie die 20-Minuten-Marke überschreiten, stoppen Sie dies und erstellen Sie eine neue STZ-Lösung, bevor Sie fortfahren. In einem separaten Rohr aliquot genug Salzlösung für die Kontrolle von Fischen. Sobald die STZ solubilisiert ist, erfordern alle nachfolgenden Schritte keine Rauchhaube.
3. Füllen Sie eine 1/2-ccm-Spritze, die mit einer 27 1/2-Spurnadel ausgestattet ist, mit der STZ oder Mitsteuerungslösungen, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden.
4. Anästhesieren Sie jeden Fisch einzeln, indem Sie die Fische in anästhetisches Wasser legen, und warten Sie, bis ihre Schwimmbewegung aufhört (1-2 min).
5. Nach der Beägung legen Sie den Fisch kurz auf ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser aufzunehmen, legen Sie den Fisch in ein wiegendes Boot und messen Sie die Masse der Fische.
6. Legen Sie den Fisch zur Injektion auf eine feste Oberfläche (Petrischalendeckel).
7. Injizieren Sie die STZ- oder Kontrolllösung in die Peritonealhöhle der Fische, indem Sie die Nadel hinter der Abschrägung in den hinteren Aspekt des ventralen Peritoneums einfügen.
8. 0,35 mg/g (350 mg/kg) STZ sollten an jeden Fisch geliefert werden, und das Volumen der benötigten 0,3%-Lösung kann wie folgt berechnet werden.
   1. Multiplizieren Sie die Masse der Fische (g) um 0,35, um die benötigte STZ-Menge in mg zu erzielen.
   2. Teilen Sie das oben erzeugte Produkt durch 3, um das Volumen der 0,3%-Lösung zu erhalten, die für die Injektion in l erforderlich ist.
      Probe: Für 0,5 g Fisch : a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175/3= 0,058 ml = 58 l.
      Das gleiche Volumen ohne die STZ würde für einen Kontrollfisch injiziert werden. Es sollte ein Blatt für Volumen erzeugt werden, das pro Fischmasse injiziert werden soll, und es sollte als Kurzanleitung verwendet werden.
9. Nach der Injektion legen Sie die Fische in den Rückgewinnungswassertank und überwachen Sie sie auf normale Schwimmaktivität. Sobald dies erreicht ist, werden die Fische in einen normalen LebendenTank überführt, der im reduzierten Temperaturbereich von 22 °C - 24 °C gehalten wird. Diese reduzierte Temperatur ist entscheidend für die effiziente Induktion von Hyperglykämie (Diabetes mellitus, DM).
10. Obwohl Hyperglykämie innerhalb von 24 Stunden nach der ersten Injektion nachgewiesen wird, um einen längeren Zustand sehr hoher Hyperglykämie zu induzieren, benötigen zebrafische eine häufige Injektionsinduktionsphase, gefolgt von wöchentlichen Erhaltungsinjektionen, wie unten gezeigt.

Woche 1: 3 Injektionen (Tag 1, 3, 5), Woche 2: 1 Injektion (Tag 12), Woche 3: 1 Injektion (Tag 19), Woche 4: (Tag 21) Durchführen eines Interessens.

An diesem Punkt gelten die Zebrafische in einem längeren Zustand der Hyperglykämie und zeigen die diabetischen Komplikationen der Retinopathie, Nephropathie und auch beeinträchtigte Flossenregeneration. Diese werden als DM-Fisch bezeichnet. Zusätzlich können die Fische auf Wunsch im hyperglykämischen Zustand mit wöchentlichen Wartungsinjektionen gehalten werden. Etwa 5 % des Todes während dieses Prozesses sollten erwartet werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.