Trattamento con streptozocina: un modello zebrafish di diabete mellito di tipo 1

Overview

Questo video descrive la tecnica di creazione di un modello zebrafish per il diabete mellito di tipo 1 con l'aiuto del farmaco Streptozocina, per studiare la fisiopatologia delle complicanze diabetiche e della memoria metabolica.

Protocol

1. Generazione di zebrafish con diabete mellito, PESCE DM

1. Preparare serbatoi di acqua sia di recupero che anestetici. L'acqua di recupero è acqua di pesce normale. Per l'acqua anestetica aggiungere sufficiente 2-fenossietanolo in modo da ottenere una diluizione 1:1.000 nell'acqua di pesce normale.
2. Preparare una soluzione allo 0,3% (in una cappa aspirante) di streptozocina (STZ) aggiungendo 6 mg di STZ a 2 ml di cloruro di sodio allo 0,09% e posizionare immediatamente la soluzione sul ghiaccio. Ciò fornirà una soluzione di iniezione sufficiente per l'iniezione di circa 20 pesci in 20 minuti. Se si supera il limite di 20 minuti, interrompere e creare una nuova soluzione STZ prima di procedere. In un tubo separato aliquota abbastanza soluzione salina per controllare i pesci. Una volta solubilizzato l'STZ, tutti i passaggi successivi non richiedono l'uso della cappa dei fumi.
3. Riempire una siringa da 1/2 cc dotata di un ago calibro 27 1/2 con STZ o soluzioni di controllo che garantiscano che non siano intrappolate bolle d'aria.
4. Anestetizza ogni pesce singolarmente mettendo il pesce in acqua anestetica e attendi fino a quando il loro movimento di nuoto cessa (1-2 minuti).
5. Una volta anestetizzato, posizionare brevemente il pesce su un tovagliolo di carta per assorbire l'acqua in eccesso, posizionare il pesce nella barca di pesare e misurare la massa del pesce.
6. Posizionare il pesce su una superficie soda (coperchio della piastra di Petri) per l'iniezione.
7. Iniettare la STZ o la soluzione di controllo nella cavità peritoneale del pesce inserendo l'ago oltre la smussatura nell'aspetto posteriore del peritoneo ventrale.
8. 0,35 mg/g (350 mg/kg) di STZ devono essere consegnati a ciascun pesce e il volume della soluzione dello 0,3% richiesta può essere calcolato nel modo seguente.
   1. Moltiplicare la massa di pesce (g) per 0,35 per produrre la quantità di STZ in mg richiesta.
   2. dividere il prodotto generato sopra per 3 per produrre il volume della soluzione dello 0,3% necessaria per l'iniezione in μl.
      Campione: Per un pesce da 0,5 g : a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) .0175/3= 0,058 ml = 58 μl.
      Lo stesso volume senza STZ sarebbe iniettato per un pesce di controllo. Un foglio per i volumi da iniettare per massa di pesce deve essere generato e utilizzato per un rapido riferimento.
9. Dopo l'iniezione posizionare il pesce nel serbatoio dell'acqua di recupero e monitorarli per la normale attività di nuoto. Una volta raggiunto questo obiettivo, il pesce viene trasferito in un normale serbatoio vivente che viene mantenuto all'intervallo di temperatura ridotto di 22 °C - 24 °C. Questa temperatura ridotta è fondamentale per un'efficace induzione di iperglicemia (diabete mellito, DM).
10. Sebbene l'iperglicemia sia rilevata entro 24 ore dalla prima iniezione, al fine di indurre uno stato prolungato di iperglicemia molto elevata, il pesce zebra richiede una frequente fase di induzione dell'iniezione seguita da iniezioni di manutenzione settimanali come mostrato di seguito.

Settimana 1: 3 iniezioni (Giorno 1, 3, 5), Settimana 2: 1 iniezione (Giorno 12), Settimana 3: 1 iniezione (Giorno 19), Settimana 4: (Giorno 21) Eseguire il saggio di interesse.

A questo punto si ritiene che i pesci zebra siano stati in uno stato prolungato di iperglicemia e mostrino le complicanze diabetiche della retinopatia, della nefropatia e anche della rigenerazione delle pinne compromessa. Questi sono indicati come pesci DM. Inoltre, se lo si desidera, il pesce può essere mantenuto allo stato iperglicemico con iniezioni di manutenzione settimanali. Ci si dovrebbe aspettare circa il 5% di morte durante questo processo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.