Индукция и оценка класса Рекомбинация коммутатор в Очищенная мышиные клетки B
Summary
После антигеном экспозицию, субпопуляции активированных В-клеток проходят процесс, известный как класс рекомбинации переключатель (КСО), чтобы произвести антитела изотипов с различными эффекторные функции. Протокол изложенные в настоящем докладе объясняет, как КСО может быть вызвана и проанализирована<em> В пробирке</em> Для целей изучения В-клеточной функции.
Abstract
Гуморальный иммунитет ветви иммунной системы ведет В-клетки и опосредуется через секрецию антител. После активации В-клеток, иммуноглобулинов локус претерпевает ряд генетических модификаций изменить связывающей способности и эффекторные функции выделяются антитела. Этот процесс будет выделено по геномной событие рекомбинации известный как класс рекомбинации переключатель (КСО), в которых антитела IgM изотипа умолчанию заменяется одним из IgG, IgA или IgE. Каждый изотип обладает различными эффекторных функций в результате чего КСО решающее значение для поддержания иммунитета.
Диверсификация иммуноглобулина локус опосредовано активации ферментов вызванных цитидиндезаминазы (AID). Схема видео, описывающие этот процесс подробно можно ознакомиться в Интернете (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). Деятельности AID и пути КСО, как правило, учились в оценке B функции клеточного и гуморального иммунитета у мышей. Протокол, изложенных в настоящем докладе представлены метод В-клеток изоляции от мышиной селезенки и последующего стимулирования с бактериальными липополисахарида (ЛПС), чтобы вызвать класс переход на IgG3 (для других изотипов антител см. Таблицу 1). Кроме того, люминесцентные ячейки окрашивания красителя карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) используется для контроля клеточного деления стимулированных клеток, процесс решающее значение для переключения изотипа 1, 2.
Регулирование AID и механизм, посредством которого происходит КСО, все еще неясны и, следовательно, в анализах пробирке класса переключатель обеспечивает надежный метод для проверки этих процессов в различных моделях мыши. Эти анализы были ранее использованы в контексте гена дефицита использованием нокаутом мышей 3. Кроме того, в пробирке переключение В-клеток может предшествовать вирусная трансдукция модулировать экспрессию генов РНК нокдаун или экспрессии трансгена 4-6. Данные из этих типов экспериментов повлияли наше понимание ПОМОЩИ деятельности, разрешение реакции КСО, и антитела, иммунитет у мышей.
Protocol
Discussion
Протокол описанных выше предоставляет стандартный анализ для анализа выражения AID и функции во время класса переключение первичных мышиных клеток. Этот протокол использует бактериальных ЛПС, чтобы вызвать переход от IgM к IgG3, хотя изменения в стимуляции массовой информации могут быть ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны лаборатории Мартина за полезные обсуждения. Эта публикация опирается на грант Канадского института исследований в области здравоохранения (СС-89783). AM поддерживается Председатель Канаде исследований премии Tier II.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
