Sınıf Anahtarı Rekombinasyon murin B Hücreleri Saf İndüksiyon ve Değerlendirme
Summary
Antijen maruz kalma ardından, aktive B hücreleri alt popülasyonlar farklı efektör fonksiyonları ile antikor isotypes üretmek için sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS) olarak bilinen bir süreç geçmesi. Bu raporda açıklanan protokol KSS uyarılan ve nasıl analiz edilebilir açıklıyor<em> In vitro</em> B hücre fonksiyonu eğitim amaçlı.
Abstract
Humoral bağışıklık, B hücreleri ve antikor salgılanmasını aracılığıyla tarafından yapılmaktadır bağışıklık sisteminin dalıdır. B hücre aktivasyonu üzerine, immünglobulin lokus bağlama kapasitesi ve salgılanan antikorlar effektör fonksiyonu değiştirmek için bir dizi genetik değişiklikler geçer. Bu süreç olduğu varsayılan IgM, IgG, IgA, veya IgE antikor izotip yerine sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS) olarak bilinen bir genomik rekombinasyon olayı tarafından vurgulanır. Her izotip, böylece bağışıklık bakım KSS önemli hale farklı efektör fonksiyonlarına sahiptir.
Immünglobulin lokus çeşitlendirilmesi enzim aktivasyonla indüklenen sitidinin deaminaz (AID) aracılığı ile. Bu süreci ayrıntılı olarak açıklayan bir şematik video online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). YARDIM faaliyet ve KSS yolağının genellikle B hücre fonksiyonu ve farelerde humoral bağışıklığın değerlendirilmesi incelenir. Bu raporda açıklanan protokol fare dalak ve sınıf diğer antikor isotypes (bkz. Tablo 1) IgG3 geçiş ikna etmek için bakteriyel lipopolisakkarit (LPS) ile sonraki stimülasyon B hücre izolasyonu bir yöntem sunuyor. Buna ek olarak, floresan hücre boyama boya Carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE) uyarılan hücreler hücre bölünmesi, anahtarlama 1, 2 izotip için çok önemli bir süreç izlemek için kullanılır.
YARDIM yönetmelik ve KSS oluştuğu mekanizması hala net değildir ve bu nedenle, in vitro sınıf anahtarı tayinlerde bu süreçlerin çeşitli fare modelleri test etmek için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu testleri daha önce, knockout farelerde 3 kullanarak gen eksikliği bağlamında kullanılmaktadır . Ayrıca, in vitro B hücreleri anahtarlama, RNA demonte veya transgen ifade 4-6 gen ekspresyonu modüle viral transdüksiyon öncesinde olabilir . Deneyler bu tür veriler YARDIM aktivite, KSS reaksiyon çözünürlük ve fare antikor-aracılı bağışıklık anlayışımızı etkiledi.
Protocol
Discussion
Yukarıda özetlenen protokol birincil fare B hücreleri sınıfı anahtarlama sırasında YARDIM ifade ve fonksiyonunu analiz etmek için standart bir tahlil sağlar. Bu protokol, diğer isotypes (Tablo 1 8, 9 özetlenmiştir) geçiş ikna etmek için uyarılması medya değişiklikler yapılabilir, ancak bakteriyel LPS, IgM gelen IgG3 geçiş ikna etmek için kullanır .
Biz henüz bilinmeyen nedenlerden dolayı, fetal buzağı serumu sınıf in vitro gözlenen anahtarlama düze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yararlı tartışmalar için Martin laboratuvara minnettarız. Bu yayın, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (MOP-89.783) bir hibe ile desteklenmektedir. PM Kanada Araştırma Başkanı Tier II Ödülü tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
