Induktion och Bedömning av klass Switch rekombination i Renad mus B-celler
Summary
Efter antigen exponering subpopulationer av aktiverade B-celler genomgå en process som kallas klass växla rekombination (CSR) för att producera antikroppar isotyper med distinkta effektorfunktioner. Det protokoll som beskrivs i denna rapport förklarar hur CSR kan induceras och analyseras<em> In vitro</em> För att studera B-cellernas funktion.
Abstract
Humorala immuniteten är den gren av immunsystemet upprätthålls av B-celler och förmedlade genom utsöndringen av antikroppar. Vid B-celler aktiveras genomgår immunglobulin lokus en serie av genetiska modifieringar för att ändra bindande kapacitet och effektor funktion utsöndras antikroppar. Denna process är markerad med en genomisk rekombination händelse kallas klass växla rekombination (CSR) som standard IgM-antikroppar isotyp ersätter en av IgG, IgA eller IgE. Varje isotyp besitter olika effektorfunktioner vilket gör CSR viktigt att upprätthålla immuniteten.
Diversifiering av immunglobulin locus medieras av enzymet aktivering-inducerad cytidindeaminas (AID). En schematisk video som beskriver denna process i detalj finns på nätet (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID: s verksamhet och CSR-väg ofta studeras i bedömningen av B-cellernas funktion och humorala immuniteten hos möss. Det protokoll som beskrivs i denna rapport presenterar en metod för B-celler isolerade från murina mjälte och efterföljande stimulering med bakteriell lipopolysackarid (LPS) för att förmå klass byta till IgG3 (för andra antikroppar isotyper se tabell 1). Dessutom är den fluorescerande cellfärgning färg Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) används för att övervaka celldelning av stimulering av celler, en process avgörande för isotyp byta 1, 2.
Regleringen av AID och mekanism genom vilken CSR förekommer fortfarande är oklara och därmed in vitro klassen växla ge en tillförlitlig metod för att testa dessa processer i olika musmodeller. Dessa analyser har tidigare använts i samband med genen brist med knockoutmöss 3. Dessutom kan in vitro-byte av B-celler att föregås av viral transduktion att modulera genuttrycket RNA ÖVERVÄLDIGANDE eller transgenen uttryck 4-6. Uppgifterna från dessa typer av experiment har påverkat vår förståelse av AID aktivitet, upplösning av CSR reaktion och antikroppsmedierat immunitet i musen.
Protocol
Discussion
Det protokoll som beskrivs ovan ger en standard test att bedöma statligt stöd uttryck och funktion under den klassen byte av primär murina B-celler. Detta protokoll använder bakteriella LPS att få byta från IgM till IgG3, även ändringar av stimulering media kan göras för att få byta till andra isotyper (sammanfattas i tabell 1 8, 9).
Vi har noterat att för ännu okända skäl kan fetalt kalvserum påverka nivån på klassen byter observerats in vitro. Det är avgörand…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot Martin laboratorium för hjälp diskussioner. Denna publikation stöds av ett stipendium från kanadensiska Institute of Health Research (MOP-89.783). AM stöds av en Canada Research Chair Tier II Award.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
