In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Live-Präparation<em> Drosophila</em> Larven zum Zwecke der Abbildung der Bewegung der GFP markierten axonalen Bläschen auf Mikrotubuli.
Abstract
Die Aufklärung der Mechanismen der axonalen Transport hat gezeigt, dass sehr wichtig bei der Bestimmung, wie Mängel in Ferntransport verschiedenen neurologischen Erkrankungen beeinflussen. Mängel in diesem wichtigen Prozess kann nachteilige Auswirkungen auf die neuronale Funktion und Entwicklung. Wir haben eine Dissektion Protokoll, das entworfen, um das Expose wird entwickelt<em> Drosophila</em> Larven segmentalen Nerven axonalen Transport in Echtzeit anzeigen. Wir haben dieses Protokoll für Live-Aufnahmen von der von Hurd und Saxton (1996) für immunolocalizatin der Larven segmentalen Nerven verwendet veröffentlicht angepasst. Eine sorgfältige Präparation und richtige Puffer-Bedingungen sind entscheidend für die Maximierung der Lebensdauer des seziert Larven. Wenn es richtig getan haben, seziert Larven robust Vesikeltransport für 2-3 Stunden unter physiologischen Bedingungen gezeigt. Wir nutzen die UAS-GAL4-Methode<sup> 1</sup> Zum Ausdruck zu bringen GFP-markierten APP oder Synaptotagmin Vesikel innerhalb eines einzigen Axon oder viele Axone in Larven segmentalen Nerven durch verschiedene neuronale GAL4-Treiber. Andere fluoreszenzmarkierten Marker, zum Beispiel Mitochondrien (MitoTracker) oder Lysosomen (LysoTracker), kann auch für die Larven vor der Anzeige angewendet werden. GFP-Vesikel Bewegung und der Bewegung von Teilchen können gleichzeitig angezeigt werden mit unterschiedlichen Wellenlängen.
Protocol
Discussion
In-vivo-Bildgebung der synaptischen Vesikel Transport innerhalb Drosophila Larve segmentalen Nerven ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Erforschung der Mechanismen in axonalen Transport. Wir haben bereits dieses Protokoll verwendet, um den Transport Dynamik innerhalb larvalen Nerven Ausdruck erweitert polyQ wiederholt, um aufzuklären, wie Ausbau der wiederholt die Dynamik der Vesikeltransport beeinflussen 3 zu bewerten. Über dieses Protokoll die Geschwindigkeit der Vesikel Bewegung…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SG wird durch Mittel aus der State University of New York at Buffalo und von John R. Oishei Foundation unterstützt.
MK wurde von einem Student Research Award CURCA bei UB unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Scientific | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | ||
| 2 Pair Forceps | Fischer Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | ||
| Box of Dissection Pins | Fine Scientific | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
