В естественных условиях Визуализация синаптических пузырьков В дрозофилы личинок Сегментные Аксоны
Summary
Этот протокол рассматривается жить рассечение<em> Drosophila</em> Личинок для визуализации движения GFP меткой аксонального пузырьки на микротрубочки треков.
Abstract
Выяснения механизмов аксонального транспорта показано, что очень важно в определении того, как дефекты в переносе на большие расстояния влияют на различные неврологические заболевания. Дефекты в этой важнейшей процесс может иметь пагубные последствия для нейронов функционирования и развития. Мы разработали протокол вскрытия, который предназначен для предоставления<em> Drosophila</em> Личиночной сегментарные нервы, чтобы посмотреть аксонального транспорта в реальном времени. Мы адаптировали данный протокол для живого изображения от той, опубликованной Херд и Сакстона (1996) используется для immunolocalizatin личинок сегментарные нервы. Тщательная диссекция и надлежащие условия буфера являются критическими для максимального срока службы расчлененный личинок. При правильно сделали, расчлененный личинок показали, надежный транспорт везикул в течение 2-3 часов при физиологических условиях. Мы используем UAS-GAL4 метод<sup> 1</sup>, Чтобы выразить GFP с метками APP или synaptotagmin везикулы в пределах одного аксона или несколько аксонов в личиночной сегментарные нервы, используя различные нейронные GAL4 водителей. Другие флуоресцентно меткой маркеры, например mitochrondria (MitoTracker) или лизосом (LysoTracker), может быть также применен к личинки перед просмотром. GFP-пузырьком движения и движения частиц можно рассматривать одновременно с использованием отдельных длинах волн.
Protocol
Discussion
В естественных изображений синаптических пузырьков в транспорте дрозофилы личиночной сегментарные нервы является мощным инструментом для изучения механизмов в аксонального транспорта. Ранее мы уже использовали этот протокол для оценки транспортной динамики внутри личин?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SG поддерживается за счет средств из государственного университета Нью-Йорка в Буффало и от Джона Р. Oishei Foundation.
МК была поддержана премии научных студенческих работ по CURCA на УБ.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Scientific | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | ||
| 2 Pair Forceps | Fischer Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | ||
| Box of Dissection Pins | Fine Scientific | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
