Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar
Summary
Este protocolo discute a dissecção ao vivo de<em> Drosophila</em> Larvas com a finalidade de imagens do movimento da GFP tag vesículas axonal em pistas de microtúbulos.
Abstract
Elucidar os mecanismos de transporte axonal tem se mostrado muito importante na determinação de como defeitos no transporte de longa distância afetam diferentes doenças neurológicas. Defeitos neste processo essencial pode ter efeitos prejudiciais no funcionamento neuronal e desenvolvimento. Nós desenvolvemos um protocolo de dissecação que é projetado para expor os<em> Drosophila</em> Larval nervos segmentares para ver o transporte axonal em tempo real. Nós adaptamos este protocolo para geração de imagens ao vivo do que foi publicado por Hurd e Saxton (1996) usado para immunolocalizatin larval de nervos segmentares. Dissecção cuidadosa e condições tampão adequada são essenciais para maximizar a vida útil das larvas dissecadas. Quando feito corretamente, as larvas dissecadas mostraram transporte vesicular robusta por 2-3 horas em condições fisiológicas. Usamos o método UAS-GAL4<sup> 1</sup> Para expressar GFP-tagged APP ou vesículas sinaptotagmina dentro de um único axônio ou axônios muitos larval nervos segmentar utilizando neuronal GAL4 diferentes drivers. Outros marcadores fluorescentes marcados, por exemplo mitochrondria (MitoTracker) ou lisossomos (Lyso Tracker), pode ser aplicado também para as larvas antes de visualizar. GFP vesícula-movimento e movimento de partículas podem ser visualizadas simultaneamente usando comprimentos de onda diferentes.
Protocol
Discussion
Na imagem in vivo de transporte dentro das vesículas sinápticas nervos Drosophila larval segmentar é uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos de transporte axonal. Nós já usou este protocolo para avaliar a dinâmica de transporte dentro nervos larval expressar repete expandiu polyQ para elucidar como a expansão de repetições afeta a dinâmica de transporte vesícula 3. Usando este protocolo a velocidade do movimento das vesículas pode ser determinada pela convers?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SG é apoiado por fundos da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo e de John R. Oishei Foundation.
MK foi apoiado por um Student Research Award por Curca na UB.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Scientific | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | ||
| 2 Pair Forceps | Fischer Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | ||
| Box of Dissection Pins | Fine Scientific | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
