العزلة وثقافة الطيور الجنينية الخلايا الاصلية صمامي
Summary
هذه المادة سوف توفر وسيلة لعزل وزراعة السمان أو الدجاج HH14<sup> –</sup> صمام الخلايا الشغاف وسادة HH25 خلايا صمام الوسيطة.
Abstract
تشكيل السليم وظيفة صمامات القلب الجنينية أمر حاسم بالنسبة لتطور التنموي. قلب الجنين في وقت مبكر هو أنبوب على شكل حرف U من البطانة وتحيط بها عضلة القلب. وتفرز عضلة القلب القلب هلام ، ومصفوفة هلامي hyaluronan الغنية ، في مفترق الطرق (AV) والقناة الأذينية البطينية تدفق (OFT) التجويف. في هذه المرحلة تبدأ عندما HH14 valvulogenesis مجموعة فرعية من الخلايا الشغاف تلقي إشارات من عضلة القلب ، والخضوع لعملية التحول الشغاف الوسيطة (EMT) ، وغزو هلام القلب. في هذه المرحلة هي HH25 mesenchymalized بالكامل وسائد الصمامات ، وهذا هو اللحمة المتوسطة التي تشكل في نهاية المطاف الجهاز الصمامات والحاجز للقلب. فهم الآليات التي تعدل والشروع في عملية التمايز الخلوي وEMT مهمة بسبب علاقتهم خطيرة عيوب خلقية في القلب. في هذه الدراسة نقدم طرق لعزل قبل EMT الشغاف وبعد EMT خلايا اللحمة المتوسطة ، والتي هما الظواهر المختلفة للخلية وسادة prevalvular. يمكن تربيتها قبل EMT الخلايا الشغاف مع أو بدون عضلة القلب. يمكن تربيتها بعد EMT خلايا اللحمة المتوسطة وسادة AV المواد الهلامية الكولاجين داخل مقيدة ميكانيكيا أو خالية من الإجهاد. هذه النماذج في 3D المختبر تحاكي الأحداث الرئيسية morphogenic صمامي ومفيدة لتفكيك آليات valvulogenesis المرحلة المبكرة والمتأخرة.
Protocol
Discussion
طريقة لعزل خلايا الشغاف من مرحلة HH14 — قلوب ضعت أصلا من قبل وRunyan Markwald يوفر للرقابة ، في بيئة المختبر لدراسة العوامل التي تشرع وتعدل EMT الجنينية 2. HH14 — سوف explants الشغاف مثقف دون الخضوع لعضلة القلب لا EMT النشاط الحيوي دون تدخل أو البيوكيميائية. إ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا البحث من قبل مؤسسة هارتويل ، وجمعية القلب الاميركية (عالم التنمية المنحة # 0830384N) ومؤسسة Leducq : 07CVD04 التاجي.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | ||
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | ||
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific | 2041S | ||
| 4-well culture plates | Nunc | 176740 | ||
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalgene | 566-0020 | ||
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR International | 25384-342 | ||
| Laboratory tape | VWR International | 89097-920 | ||
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | ||
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | ||
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | ||
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | ||
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | ||
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | |||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).
