Questo articolo fornisce un metodo per isolare e quaglia coltura o pollo HH14<sup> -</sup> Valvola di cellule endocardico e HH25 cellule mesenchimali cuscino valvola.
Abstract
Un'adeguata formazione e la funzione delle valvole cardiache embrionali è fondamentale per la progressione di sviluppo. Il cuore embrionale precoce è un tubo a U di endocardio circondato da miocardio. Miocardio secerne pappa cardiaci, un acido ialuronico ricco di matrice gelatinosa, nel nodo atrioventricolare (AV) e del tratto di efflusso (OFT) lumen. Nella fase HH14 valvulogenesis inizia quando un sottogruppo di cellule endocardico ricevere segnali dai miocardio, sottoposti endocardico alla trasformazione mesenchimale (EMT), e invadono la pappa cardiaci. Nella fase HH25 i cuscini sono completamente valvolare mesenchymalized, ed è questo mesenchima che forma poi l'apparato valvolare e del setto del cuore. La comprensione dei meccanismi che innescano e modulano il processo di differenziazione delle cellule EMT e sono importanti per la loro connessione con gravi difetti cardiaci congeniti. In questo studio presenteremo i metodi per isolare pre-EMT endocardico e post-EMT cellule mesenchimali, che sono le due fenotipi cellulari diversi del cuscino prevalvular. Pre-EMT cellule endocardico possono essere coltivate con o senza il miocardio. Post-EMT cuscino AV cellule mesenchimali possono essere coltivate gel di collagene all'interno meccanicamente vincolato o senza stress. Queste 3D in modelli in vitro imitare principali eventi morfogenici valvolare e sono utili per decostruire i meccanismi di valvulogenesis fase precoce e tardiva.
Protocol
1. Preparazione Incubare uova di quaglia fertile o pollo allo stadio 14 – (circa 2 giorni) o 25 (circa 4,5 giorni) a 60% di umidità e 37 ° C. Preparare la soluzione Balanced Salt Earl è sterile (EBSS) Aggiungere 100 mL EBSS 10X a 600 ml di acqua 18 MΩ Aggiungere 2,2 g di sodio bicarbonato Regolare il pH della soluzione a 7,2 Portare la soluzione fino a 1000 ml Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro 0,2 micron </l…
Discussion
Il metodo per isolare le cellule endocardico da stadio HH14 – Cuori originariamente sviluppato da Runyan e Markwald fornisce una controllata, in ambiente vitro per studiare i fattori che innescano e modulano embrionale EMT 2. HH14 – espianti endocardico colta senza miocardio non subirà EMT senza l'intervento biomeccanici o biochimici. Se il miocardio è lasciato sul espianto sarà il segnale di un sottogruppo di cellule endocardico a subire la trasformazione mesenc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è sostenuta dalla Fondazione Hartwell, l'American Heart Association (Scientist Development Grant # 0830384N) e la Fondazione Leducq: 07CVD04 mitrale.
Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (44), e2159, doi:10.3791/2159 (2010).