Aislamiento y cultivo de células embrionarias progenitoras aviar valvular
Summary
En este artículo se proporciona un método para aislar y cultivar la codorniz o pollo HH14<sup> -</sup> Válvula de células del endocardio y HH25 células mesenquimales amortiguador de la válvula.
Abstract
Formación adecuada y la función de las válvulas del corazón embrionario es crítica para la progresión del desarrollo. El corazón embrionario temprano es un tubo en forma de U del endocardio rodeado de miocardio. El miocardio secreta gelatina cardíaca, una matriz rica en ácido hialurónico gelatinosa, en el nódulo auriculoventricular (AV) y el tracto de salida (OFT) del lumen. En la etapa HH14 valvulogenesis comienza cuando un subconjunto de las células endocárdicas, recibir señales de miocardio, endocardio someterse a la transformación de mesenquimales (EMT), e invadir la gelatina cardíaca. En la etapa HH25 los cojines son totalmente valvular mesenchymalized, y esto es lo que finalmente mesénquima forma el aparato valvular y del tabique del corazón. Comprensión de los mecanismos que inician y modulan el proceso de diferenciación celular y la EMT son importantes debido a su conexión con graves defectos congénitos del corazón. En este estudio se presentan los métodos para aislar pre-EMT endocárdica y después de la EMT células mesenquimales, que son los dos diferentes fenotipos de células del cojín prevalvular. Pre-EMT endocardial células pueden ser cultivadas con o sin el miocardio. Después de la EMT células mesenquimales colchón AV pueden ser cultivadas en el interior mecánicamente restringido o sin estrés geles de colágeno. Estas 3D en modelos in vitro imitar los principales eventos morfogénicos valvular y son útiles para la deconstrucción de los mecanismos de valvulogenesis etapa temprana y tardía.
Protocol
Discussion
El método para aislar células del endocardio de la etapa HH14 – corazones desarrollado originalmente por Runyan y Markwald proporciona un entorno controlado, en el entorno in vitro para estudiar los factores que inician y modular embrionarias EMT 2. HH14 – explantes cultivados sin endocardio miocardio no someterse a EMT, sin intervención biomecánicas o bioquímicas. Si el miocardio se deja en el explante se dará la señal de un subconjunto de las células endocárd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación es apoyada por la Fundación Hartwell, la Asociación Americana del Corazón (Desarrollo Científico Subvención # 0830384N) y la Fundación Leducq: 07CVD04 mitral.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | ||
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | ||
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific | 2041S | ||
| 4-well culture plates | Nunc | 176740 | ||
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalgene | 566-0020 | ||
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR International | 25384-342 | ||
| Laboratory tape | VWR International | 89097-920 | ||
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | ||
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | ||
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | ||
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | ||
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | ||
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | |||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).
