विकिरण के बाद γH2AX के स्थानिक वितरण का मूल्यांकन
Summary
ΓH2AX foci, जो Ser-139 H2AX के डीएनए डबल भूग्रस्त टूटता है के जवाब में phosphorylation निम्नलिखित फार्म का सूक्ष्म विश्लेषण विकिरण जीव विज्ञान में एक अमूल्य उपकरण बन गया है. यहाँ हम मोनो – methylated histone H3 सक्रिय transcribing euchromatin के एक epigenetic मार्कर के रूप में 4 lysine पर एक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया, नाभिक के भीतर विकिरण प्रेरित γH2AX गठन के स्थानिक वितरण का मूल्यांकन.
Abstract
डीएनए डबल भूग्रस्त टूटता है (DSBs) के लिए एक प्रारंभिक आणविक प्रतिक्रिया Ser-139 histone H2AX 1,2 के टर्मिनल SQEY आकृति के भीतर अवशेषों की phosphorylation है. H2AX की इस phosphorylation 3-kinase phosphatidyl – inosito (PI3K) प्रोटीन के परिवार, गतिभंग telangiectasia उत्परिवर्तित (एटीएम), डीएनए प्रोटीन kinase उत्प्रेरक सबयूनिट और एटीएम और 3 RAD3 से संबंधित (एटीआर) द्वारा मध्यस्थता है. H2AX की phosphorylated फार्म γH2AX के रूप में संदर्भित, DSB की साइट से chromatin के आसन्न क्षेत्रों के लिए, फैलता है, असतत foci, जो आसानी से immunofluorecence 3 माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना कर रहे हैं बनाने. विश्लेषण और γH2AX foci के quantitation व्यापक रूप से किया गया है DSB गठन और विशेष रूप से विकिरण के जवाब में और विभिन्न यौगिकों और साइटोटोक्सिक यौगिकों 4 संशोधित विकिरण की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए की मरम्मत, का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया.
उत्तम और DSBs के इस नोवो डे मार्कर की विशिष्टता संवेदनशीलता को देखते हुए, यह डीएनए और chromatin के संदर्भ में क्षति की मरम्मत की प्रक्रिया में नए अंतर्दृष्टि प्रदान की है. उदाहरण के लिए, विकिरण जीव विज्ञान में केंद्रीय प्रतिमान यह है कि परमाणु डीएनए विकिरण संवेदनशीलता के लिए सम्मान के साथ महत्वपूर्ण लक्ष्य है. वास्तव में, क्षेत्र में आम सहमति काफी हद तक डीएनए नुकसान और मरम्मत के लिए एक सजातीय टेम्पलेट के रूप में chromatin देखने के लिए किया गया है. हालांकि, DSBs के आणविक मार्कर, γ-विकिरण प्रेरित euchromatin और heterochromatin में γH2AX foci गठन में असमानता के रूप में γH2AX का उपयोग के साथ 5-7 मनाया गया है. हाल ही में, हम एंटीबॉडी के एक पैनल का इस्तेमाल या तो मोनो di या त्रिकोणीय methylated 9 lysine पर histone H3 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) जो विधान heterochromatin और transcriptional मुंह बंद और 4 lysine के epigenetic imprints (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), जो कसकर सक्रिय euchromatic क्षेत्रों transcribing सहसंबद्ध होते हैं, निम्नलिखित ionizing विकिरण 8 γH2AX के स्थानिक वितरण की जांच . Chromatin जीव विज्ञान के बारे में प्रचलित विचारों के अनुसार, हमारे निष्कर्ष γH2AX गठन और सक्रिय प्रतिलेखन 9 के बीच एक करीबी संबंध में संकेत दिया. यहाँ हम पता लगाने और गैर पक्षपाती कोशिकाओं में quantitation γH2AX foci के लिए अन्य epigenetic मार्करों, छवि विश्लेषण और 3 डी मॉडलिंग के साथ एक सह स्थानीयकरण पर विशेष ध्यान देने के साथ हमारे immunofluorescence विधि, प्रदर्शित.
Protocol
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
परमाणु विज्ञान और इंजीनियरिंग के ऑस्ट्रेलियाई संस्थान का समर्थन स्वीकार किया है. TCK AINSE पुरस्कार के प्राप्तकर्ता था. Epigenomic चिकित्सा लैब राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (566,559) द्वारा समर्थित है. बायोमेडिकल इमेजिंग विकास लिमिटेड के लिए इस काम के लिए सीआरसी द्वारा वित्त पोषित है, की स्थापना की और ऑस्ट्रेलियाई सरकार ने सहकारी अनुसंधान केंद्र (सीआरसी) कार्यक्रम के अंतर्गत समर्थित. LM मेलबोर्न (मेलबोर्न विश्वविद्यालय) अनुसंधान और बायोमेडिकल इमेजिंग सीआरसी अनुपूरक छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है. मोनाश माइक्रो इमेजिंग के समर्थन (डीआरएस स्टीफन कोड़ी और Iśka Carmichael) इस काम के लिए अमूल्य था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore, USA | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam, Cambridge, UK | AB8895 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11035 | |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen, USA | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
| Polylysine slides | Menzel-Gläser, Germany | |||
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Shandon Cytospin 4 | ThermoElectron Corp | |||
| Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
| Filter Cards | Shandon, Inc | 353025 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| PAP Pen | Zymed Laboratories, Invitrogen | 008877 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
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