Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

Summary

Die mikroskopische Analyse von γH2AX Herde, die im Anschluss an die Phosphorylierung von H2AX an Ser-139 in Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche zu bilden, hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier haben wir ein Antikörper gegen mono-methylierte Histon H3 an Lysin 4 als epigenetische Marker aktiv Transkription Euchromatin, um die räumliche Verteilung der Strahlung induzierten γH2AX Bildung innerhalb des Zellkerns zu bewerten.

Abstract

Eine frühe molekulare Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) ist die Phosphorylierung des Ser-139-Rest innerhalb der Terminal SQEY Motiv des Histon H2AX ^1,2. Diese Phosphorylierung von H2AX wird durch die Phosphatidyl-inosito-3-Kinase (PI3K)-Familie von Proteinen, Ataxie Teleangiektasien mutiert (ATM), DNA-Protein-Kinase-katalytischen Untereinheit und ATM und Rad3-bezogene (ATR) ³ vermittelt. Die phosphorylierte Form von H2AX, die so genannte γH2AX, breitet sich auf benachbarte Regionen des Chromatins von der Website des DSB bilden diskrete Herde, die leicht visualisiert immunofluorecence Mikroskopie ³ sind. Analyse und Quantifizierung von γH2AX Herden wurde in großem Umfang verwendet werden, um DSB Bildung und Reparatur, insbesondere als Reaktion auf ionisierende Strahlung und zur Bewertung der Wirksamkeit verschiedener Strahlung modifizierende Verbindungen und zytotoxischen Verbindungen ⁴ bewerten.

Angesichts der exquisiten Spezifität und Sensitivität dieser de novo Marker DSBs, hat sie neue Einblicke in die Prozesse der DNA-Schädigung und Reparatur im Rahmen von Chromatin zur Verfügung gestellt. Zum Beispiel in der Strahlenbiologie das zentrale Paradigma ist, dass die Kern-DNA der kritischen Ziel in Bezug auf die Strahlenempfindlichkeit ist. In der Tat hat der allgemeine Konsens im Bereich weitgehend an das Chromatin als eine homogene Vorlage für DNA-Schäden und Reparatur zu sehen. Allerdings hat mit dem Einsatz von γH2AX als molekulare Marker für DSBs, eine Ungleichheit in γ-Bestrahlung induzierten γH2AX Foci-Bildung in Euchromatin und Heterochromatin beobachtet worden ^5-7. Kürzlich haben wir eine Gruppe von Antikörpern, entweder mono-, di-oder tri-methyliert Histon H3 an Lysin 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), die epigenetischen Prägungen der konstitutiven Heterochromatin und transkriptionellen Silencing und Lysin 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 sind ), die eng korreliert aktiv Transkription euchromatischen Regionen, um die räumliche Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung ⁸ zu untersuchen. In Übereinstimmung mit der herrschenden Vorstellungen über Chromatin Biologie, angegeben unsere Ergebnisse eine enge Korrelation zwischen γH2AX Bildung und aktive Transkription ^9. Hier zeigen wir unsere Immunfluoreszenz Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von γH2AX Brennpunkte in nicht-haftenden Zellen mit einem besonderen Fokus auf Co-Lokalisation mit anderen epigenetischen Markierungen, Bildanalyse und 3D-Modellierung.

Protocol

Zellpräparation Menschliche erythroleukämische K562-Zellen werden in RPMI-1640 Medium mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum und 20 mg / ml Gentamicin in einem befeuchteten 5% CO 2-Umgebung bei 37 ° C ergänzt gewachsen Etwa 18 Stunden vor dem Färben waschen exponentiell wachsenden Zellen (optimal bei 5 x 10 5 Zellen / ml) mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), in frischen Medien und zurück auf 37 resuspendieren ° C, 5% CO 2. Waschen Sie die Ze…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	Millipore, USA	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam, Cambridge, UK	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen, USA	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Gläser, Germany
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Gläser, Germany	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Falcon	353112
Shandon Cytospin 4		ThermoElectron Corp
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Invitrogen	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices, USA