Utvärdering av den geografiska fördelningen av γH2AX efter joniserande strålning

Summary

Mikroskopisk analys av γH2AX härdar, som utgör efter fosforyleringen av H2AX vid Ser-139 som svar på DNA dubbel-strängbrott, har blivit ett ovärderligt verktyg i strålningsbiologi. Här har vi använt en antikropp mot mono-metylerat histon H3 på lysin 4 som en epigenetisk markör för aktivt transkribera euchromatin, för att utvärdera den geografiska fördelningen av strålningsinducerad γH2AX bildning inom kärnan.

Abstract

En tidig molekylärt svar på DNA dubbel-strängbrott (DSBs) är fosforyleringen av Ser-139 rester i terminalen SQEY motiv av histon H2AX ^1,2. Denna fosforylering av H2AX medieras av det fosfatidyl-inosito 3-kinas (PI3K) familj av proteiner, ataxi telangiectasia muterad (ATM), DNA-protein kinas katalytiska subenheten och ATM och RAD3-relaterade (ATR) ^3. Den fosforyleras form av H2AX, kallad γH2AX, sprider sig till angränsande regioner i kromatin från platsen för DSB, som utgör diskreta fokus, som är lätt synliga genom immunofluorecence mikroskopi ^3. Analys och kvantifiering av γH2AX foci har i stor utsträckning används för att utvärdera DSB bildning och reparation, särskilt som svar på joniserande strålning och för att utvärdera effekten av olika strålning ändra föreningar och cytostatika ^4.

Med tanke på den utsökta specificitet och känslighet för denna de novo markör av DSBs har det gett nya insikter i processer av DNA-skador och reparation i samband med kromatin. Till exempel i strålningsbiologi den centrala paradigmet är att kärn-DNA är den kritiska mål med avseende på strålning känslighet. Faktum är att den allmänna uppfattningen i fältet till stor del att se kromatin som en homogen mall för DNA-skador och reparation. Har dock med hjälp av γH2AX som molekylär markör av DSBs, en skillnad i γ-bestrålning-inducerad γH2AX härdar bildas i euchromatin och heterochromatin observerats ^5-7. Nyligen använde vi en panel av antikroppar mot antingen mono-, di-eller tri-metylerat histon H3 på lysin 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) som är epigenetiska avtryck av konstitutivt heterochromatin och transkriptionell tysta och lysin 4 H3K4me1 (, H3K4me2, H3K4me3 ), som är tätt korrelerade aktivt transkribera euchromatic regioner, för att undersöka den geografiska fördelningen av γH2AX efter joniserande strålning ^8. I enlighet med rådande idéer om kromatin biologi, visade våra resultat ett nära samband mellan γH2AX bildning och aktiv transkription ^9. Här kan vi visa vår immunofluorescens metod för detektion och kvantifiering av γH2AX foci i icke-häftande celler, med särskilt fokus på samarbete lokalisering med andra epigenetiska markörer, bildanalys och 3D-modellering.

Protocol

Cellberedningen Mänskliga erythroleukemic K562-celler odlas i RPMI-1640 mediet kompletteras med 10% (v / v) fetalt bovinserum och 20 mg / ml gentamicin i en fuktig 5% CO 2 miljö vid 37 ° C. Cirka 18 timmar före färgningen tvätta exponentiellt växande celler (optimal vid 5 x 10 5 celler / ml) med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), resuspendera i färskt media och återgå till 37 ° C, 5% CO 2. Tvätta cellerna två gånger med PBS genom centrifugering…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	Millipore, USA	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam, Cambridge, UK	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen, USA	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Gläser, Germany
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Gläser, Germany	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Falcon	353112
Shandon Cytospin 4		ThermoElectron Corp
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Invitrogen	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices, USA