Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

Summary

Analisi al microscopio di γH2AX focolai, che formano in seguito alla fosforilazione di H2AX a livello della serina-139 in risposta a DNA a doppio filamento, è diventato uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui abbiamo usato un anticorpo mono-istone H3 metilato in lisina 4 come marker epigenetici attivamente eucromatina di trascrizione, di valutare la distribuzione spaziale della radiazione indotta formazione γH2AX all'interno del nucleo.

Abstract

Una risposta precoce molecolare a DNA a doppio filamento (DSB) è la fosforilazione della Ser-139 residui all'interno del motivo terminale SQEY del ^1,2 istone H2AX. Questa fosforilazione di H2AX è mediato dalla fosfatidil-inosito 3-chinasi (PI3K) famiglia di proteine, atassia telangiectasia mutati (ATM), DNA-proteina chinasi subunità catalitiche e ATM e RAD3-correlate (ATR) ^3. La forma fosforilata di H2AX, denominato γH2AX, si estende alle regioni limitrofe della cromatina dal sito del DSB, formando focolai distinti, che sono facilmente visibili al microscopio immunofluorecence ^3. L'analisi e la quantificazione di γH2AX focolai è stato ampiamente utilizzato per valutare la formazione di DSB e la riparazione, in particolare in risposta alle radiazioni ionizzanti e per valutare l'efficacia di radiazione modificando vari composti e composti citotossici ^4.

Data la specificità e la squisita sensibilità di questo marcatore de novo di DSB, ha fornito nuove informazioni sui processi di danno e riparazione del DNA nel contesto della cromatina. Ad esempio, nella biologia radiazione il paradigma centrale è che il DNA nucleare è l'obiettivo fondamentale rispetto alla sensibilità alle radiazioni. Infatti, il consenso generale del settore è stato in gran parte per visualizzare cromatina come un modello omogeneo per danno e riparazione del DNA. Tuttavia, con l'uso di γH2AX come marcatore molecolare di DSB, una disparità di γ-irradiazione indotto la formazione di focolai in γH2AX eucromatina ed eterocromatina è stato osservato ^5-7. Recentemente, abbiamo utilizzato un pannello di anticorpi sia mono-, di-o tri-istone H3 metilato in lisina 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) che sono impronte epigenetiche di eterocromatina costitutiva e silenziamento trascrizionale e lisina 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), che sono strettamente correlate attivamente trascrizione regioni eucromatiche, per studiare la distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti ^8. In conformità con le idee prevalenti quanto riguarda la biologia della cromatina, i nostri risultati indicato una stretta correlazione tra la formazione e la trascrizione γH2AX attivo ^9. Qui mostriamo il nostro metodo di immunofluorescenza per la rilevazione e quantificazione di γH2AX focolai in cellule non-aderenti, con un focus particolare sulla co-localizzazione con altri marcatori epigenetici, analisi di immagine e di modellazione 3D.

Protocol

Preparazione delle cellule Umano erythroleukemic K562 cellule sono coltivate in RPMI-1640 medium supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e 20 mg / ml di gentamicina in un umidificata al 5% CO 2 ambiente a 37 ° C. Circa 18 ore prima della colorazione lavare cellule in crescita esponenziale (ottimale a 5 x 10 5 cellule / ml) con tampone fosfato (PBS), risospendere in mezzi freschi e ritorno a 37 ° C, 5% di CO 2. Lavare le cellule due volte con …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	Millipore, USA	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam, Cambridge, UK	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen, USA	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Gläser, Germany
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Gläser, Germany	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Falcon	353112
Shandon Cytospin 4		ThermoElectron Corp
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Invitrogen	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices, USA