में अंकित जीन के डीएनए मेथिलिकरण का निर्धारण Arabidopsis Endosperm
Summary
Imprinting संयंत्र और स्तनपायी प्रजनन में एक घटना है. डीएनए मेथिलिकरण imprinting के तंत्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. एण्डोस्पर्म अलग और में अंकित जीन की मेथिलिकरण स्थिति का निर्धारण<em> Arabidopsis</em> मुश्किल हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम का वर्णन कैसे एण्डोस्पर्म को अलग करने के लिए और bisulfite अनुक्रमण द्वारा मेथिलिकरण निर्धारित.
Abstract
Arabidopsis thaliana epigenetic तंत्र के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है. कारणों में से एक है हानि के समारोह डीएनए methyltransferases के अशक्त उत्परिवर्ती व्यवहार्य है, इस तरह एक प्रणाली के लिए अध्ययन कैसे एक जीनोम में डीएनए मेथिलिकरण की हानि वृद्धि और विकास को प्रभावित करता है प्रदान. Imprinting मातृ और पैतृक alleles के अंतर अभिव्यक्ति के लिए संदर्भित करता है और दोनों स्तनपायी और पौधों में प्रजनन के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. डीएनए मेथिलिकरण निर्धारित करता है कि एक अंकित जीन की मातृ या पैतृक alleles व्यक्त की है या खामोश करने के लिए महत्वपूर्ण है. फूल पौधों में, वहाँ प्रजनन में एक डबल निषेचन घटना है: एक शुक्राणु सेल अंडा सेल केंद्रीय कक्ष के साथ एण्डोस्पर्म को जन्म दे भ्रूण और एक दूसरे शुक्राणु फ़्यूज़ के फार्म fertilizes. Endosperm ऊतक जहां imprinting पौधों में होता है Medea, एक सेट डोमेन Polycomb समूह जीन, और FWA, एक प्रतिलेखन विनियमन कारक फूल, पहले दो एण्डोस्पर्म और उनकी अभिव्यक्ति में अंकित होना दिखाया जीन में डीएनए मेथिलिकरण और demethylation द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं पौधों. आदेश में एक जीन और एण्डोस्पर्म में मेथिलिकरण पैटर्न की imprinting स्थिति निर्धारित करने के लिए, हम एण्डोस्पर्म पहले अलग करने में सक्षम होने की जरूरत है. चूंकि बीज Arabidopsis में छोटे है, यह Arabidopsis एण्डोस्पर्म अलग चुनौती बनी हुई है और इसकी मेथिलिकरण की जांच . इस वीडियो प्रोटोकॉल में, हम रिपोर्ट है कि एक आनुवंशिक पार कैसे आचरण करने के लिए, बीज से एण्डोस्पर्म ऊतक अलग करने के लिए, और bisulfite अनुक्रमण द्वारा मेथिलिकरण स्थिति का निर्धारण.
Protocol
Discussion
यह अपेक्षाकृत आसान एण्डोस्पर्म और बीज कोट से भ्रूण अलग है, लेकिन यह बीज कोट से अलग एण्डोस्पर्म, embryogenesis के प्रारंभिक या मध्य टारपीडो स्तर पर बीज के लिए विशेष रूप से कठिन है. चूंकि बीज कोट केवल ऊतक का एक बहुत…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों सुश्री जेनिफर एम. Lommel और तारा एन Rognan Arabidopsis पौधों के रखरखाव के लिए धन्यवाद . यह काम शुरू हुआ – सेंट लुई विश्वविद्यालय और संस्थान राष्ट्रीय स्वास्थ्य 1R15GM086846-01 और डब्ल्यू जिओ 3R15GM086846-01S1 अनुदान के से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
Supplies
- Dissecting Microscope
- Scissors
- Fine Tip Forceps
- Jewelry Tag
- Plant Stakes
- String or Twist-Ties
- 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
- 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
- Liquid Nitrogen
- Liquid Nitrogen Containers
- Heat Block
- PCR Tubes
- Thermocycler
- Microcentrifuge Tubes
- Microcentrifuge
- Gel Electrophoresis facility
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants
Reagents
- 70% Ethanol
- 95% Ethanol
- 100% Ethanol
- 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
- 100% Ethanol
- Cholorform
- Restriction Enzymes
- 3 M NaOH
- 6.3 M NaOH
- 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
- Sterile distilled H2O
- 10 mM Hydroquinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH4OAc
- 20 μg/ μL tRNA
- TE buffer
- The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
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