쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Summary

쥐 말라리아 기생충의 유전자 십자가는 모기에 두 유전자 별개의 기생충을 먹이에 의해 수행됩니다. 재조합 자손은 모기가 감염된 쥐를 물어 수 있도록 후 마우스 혈액에서 복제됩니다. 이 비디오의 유전자 십자가를 생산하는 방법을 보여줍니다<em> Plasmodium yoelii</em> 기타 설치류의 말라리아 기생충에 적용됩니다.

Abstract

antimalarial 약물에 대한 응답과 말라리아 기생충의 pathogenicity의 변화는 생물 학적 및 의료 중요하다. 연계 매핑 ^1-3 설치류와 인간의 ^4-6 말라리아 기생충의 다양한 특성을 기본 유전자 또는 loci 성공적으로 확인되었다. 말라리아 기생충 Plasmodium yoelii 야생 아프리카 설치류로부터 분리된 많은 말라리아 종 중 하나이며 실험실에서 성장에 적응되었습니다. 이 종족은 인간의 말라리아 기생충의 생물 학적 특성 중 많은 것들을 재현한, 같은 microsatellite 및 증폭 단편의 길이 다형성 (AFLP) 마커와 같은 유전자 마커 또한 기생충 ^7-9 위해 개발되었습니다. 따라서, 쥐 말라리아 기생충의 유전자 연구는 Plasmodium falciparum에 대한 연구를 보완하기 위해 수행할 수 있습니다. 여기, 우리는 P.의 유전 십자가를 생산을위한 기술을 보여줍니다 첫째 DRS에 의해 개척되었다 yoelii. 데이비드 Walliker, 리차드 카터와 에딘버러 (Edinburgh) ¹⁰ 대학에서 동료.

P.의 유전 십자가 yoelii 및 기타 설치류의 말라리아 기생충은 관심의 phenotypes와 모기가 사일 감염 후 감염된 생쥐에서 피드 수에 따라 다릅니다 두 유전자 별개의 클론의 gametocytes를 포함 inoculum와 쥐 뮤스의 musculus를 감염에 의해 실시하고 있습니다. 마우스 혈액에서 남성과 여성 gametocytes의 존재는 미세 이송하기 전에 확인합니다. 수유 후 48 시간 이내에 모기의 midgut에서 haploid gametocytes은 남성과 여성의 gametes에 차별 비옥하고, diploid의 접합자 (그림 1) 형태. ookinete에 접합자의 개발 과정, 감수 분열 ¹¹ 발생 나타납니다. 접합자는 두 유전자 별개의 기생충, 유전자 교류 (. 상동 염색체의 쌍 비 자매 chromatids 사이의 염색체 reassortment 상호 오버, 그림 2) gametes 사이의 교차 수정을 통해 파생하는 경우는 재조합의 결과가 발생할 수 있습니다 동종 loci에서 유전 물질. 각 접합자 네 haploid의 핵 이어지는 두 개의 연속 핵 분열을 겪습. ookinete 추가 oocyst으로 개발하고 있습니다. oocyst가 성숙되면, sporozoites (십자가의 자손)의 수천이 형성 및 모기 hemoceal로 출시됩니다. Sporozoites는 침샘에서 수확 및 사전 erythrocytic 및 erythrocytic 단계 개발이 이루어지는 새로운 murine 호스트로 주입됩니다. Erythrocytic 양식은 복제와 유전 결합 매핑하기 전에 부모의 라인을 구분 문자에 관한 분류됩니다. 개별 부모 클론 제어 감염은 유전 십자가의 생산과 같은 방식으로 수행됩니다.

Protocol

무균 기술은 실험 결과를 혼란시킬 수있는 마우스로 외인성 감염 요원의 실수로 도입을 피하기 위해 동물로 administrated 될 모든 재료에 적용해야합니다. 1. 피를 단계 말라리아 기생충과 실험실 쥐를 감염 상온에서, 냉동 혈액 단계 말라리아 기생충을 포함하는 두 병이 깨지는 해동. 이 예제에서 사용이 쥐 말라리아 기생충의 종자는 Plasmodium yoelii yoelii 및 Plas…

Discussion

우리는 또한 다른 쥐 malarias의 유전 십자가의 생산에 적용되는 설치류 말라리아 Plasmodium yoelii에서 유전자 십자가의 생산을위한 기술을 보여줍니다. 단일 클론 부모와 생쥐의 감염은 대개 부모가 십자가를 수행하기 전에 기능 gametes를 생산 능력이 있는지 확인하는 부모 기생충의 성공적인 전송을 결정하기 위해 수행됩니다.

모기를 통해 성공적인 전송이 insectary의 온도…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Glyerolyte 57 solution		Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus		Charles River Laboratory		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum		Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution		Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium yoelii yoelii 17XNL(1.1)		MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium yoelii nigeriensis N67		MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi		MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter		Nexcelom Biosciences	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer		Nexcelom Biosciences	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit		Roche Applied Science	11 796 828 001
Calcium chloride		Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified		Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride		Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride		Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride		Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate		Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine		Akorn Inc.	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool		VWR	32848-003
Glass capillary (1 μL)		VWR	53440-001
Hemocytometer		VWR	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer		VWR	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

• Maintenance of laboratory mice
• Maintenance of laboratory mosquitoes
• Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
• Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquitoes

Mosquitoes are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium yoelii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquitoes are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm³ open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 10⁷ infected RBC intraperitoneally or 10⁶ infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as “in” if it overlaps the top or right lines and “out” if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the “red blood cell” option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.