Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

Summary

Cruces genéticos de los parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo por la alimentación de dos parásitos genéticamente distintos a los mosquitos. Recombinante progenie clonada a partir de la sangre del ratón después de permitir que los mosquitos que pican ratones infectados. Este vídeo muestra cómo se producen los cruces genéticos de<em> Plasmodium yoelii</em> Y es aplicable a otros parásitos de roedores malaria.

Abstract

Variación en la respuesta a los medicamentos antimaláricos y en la patogenicidad de los parásitos de la malaria es de importancia biológica y médica. Mapas de los vínculos ha llevado a la identificación exitosa de los genes o loci subyacente varios rasgos en los parásitos del paludismo de los roedores y los humanos ^{1-3 4-6.} El parásito de la malaria Plasmodium yoelii es una de las especies de malaria muchos aislado de roedores silvestres de África y ha sido adaptado para crecer en el laboratorio. Esta especie se reproduce muchas de las características biológicas de los parásitos del paludismo humano; marcadores genéticos como los microsatélites y marcadores de fragmentos amplificados polimorfismo en la longitud (AFLP) también se han desarrollado para el parásito de ^7-9. Así, los estudios genéticos de los parásitos del paludismo de roedores se pueden realizar para complementar la investigación sobre el Plasmodium falciparum. En este sentido, demostrar las técnicas para la producción de un cruce genético de P. yoelii que fueron los primeros por primera vez por los Dres. David Walliker, Richard Carter, y sus colegas de la Universidad de Edimburgo ^10.

Cruces genéticos de P. yoelii y otros parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo mediante la infección de ratones Mus musculus con un inóculo que contiene gametocitos de dos clones genéticamente distintas que se diferencian en fenotipos de interés y permitiendo que los mosquitos que se alimentan de los ratones infectados cuatro días después de la infección. La presencia de gametocitos masculinos y femeninos en la sangre del ratón es microscópicamente confirmados antes de alimentar. Dentro de las 48 horas después de comer, en el intestino medio del mosquito, los gametocitos haploides se diferencian en gametos masculinos y femeninos, fertilizar, y forma un cigoto diploide (Fig. 1). Durante el desarrollo de un cigoto en un oocineto, meiosis parece ocurrir ^11. Si el cigoto se deriva a través de la fertilización cruzada entre los gametos de los dos parásitos genéticamente distintos, los intercambios genéticos (recombinación cromosómica y cross-overs entre las cromátidas no hermanas de un par de cromosomas homólogos;. Fig. 2) puede ocurrir, resultando en la recombinación de material genético en loci homólogos. Cigoto experimenta dos divisiones nucleares sucesivas, dando lugar a cuatro núcleos haploides. Un oocineto más se convierte en un ooquiste. Una vez que el ooquiste madura, miles de esporozoitos (la descendencia de la cruz) se forman y se liberan en hemoceal mosquito. Esporozoitos se cosechan a partir de las glándulas salivales y se inyecta en un nuevo huésped murino, donde el desarrollo de la etapa pre-eritrocítica y eritrocítica se lleva a cabo. Formas eritrocíticas se clonan y se clasifican con respecto a los caracteres distintivos de las líneas parentales antes de mapeo de ligamiento genético. Control de las infecciones de los distintos clones de los padres se llevan a cabo en la misma forma que la producción de un cruce genético.

Protocol

Técnicas de asepsia deben ser aplicadas a todos los materiales que serán administrados a los animales para evitar la introducción accidental de agentes infecciosos exógenos en los ratones que se pueden confundir los resultados experimentales. 1. La infección de ratones de laboratorio con parásitos de la malaria el estadio en sangre A temperatura ambiente, descongelar dos viales que contienen la sangre congelada parásitos de la malaria etapa que se cruzaron. En este ejemplo,…

Discussion

Nos demuestran las técnicas para la producción de un cruce genético de los roedores malaria Plasmodium yoelii, que también es aplicable a la producción de cruces genéticos en malarias roedores. Infecciones de los ratones con un solo clones parentales usualmente se realizan para determinar la transmisión correcta de los parásitos de los padres para asegurarse de que los padres son competentes en la producción de gametos funcionales antes de realizar una cruz.

Transmisión co…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Glyerolyte 57 solution		Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus		Charles River Laboratory		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum		Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution		Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium yoelii yoelii 17XNL(1.1)		MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium yoelii nigeriensis N67		MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi		MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter		Nexcelom Biosciences	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer		Nexcelom Biosciences	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit		Roche Applied Science	11 796 828 001
Calcium chloride		Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified		Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride		Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride		Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride		Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate		Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine		Akorn Inc.	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool		VWR	32848-003
Glass capillary (1 μL)		VWR	53440-001
Hemocytometer		VWR	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer		VWR	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

• Maintenance of laboratory mice
• Maintenance of laboratory mosquitoes
• Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
• Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquitoes

Mosquitoes are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium yoelii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquitoes are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm³ open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 10⁷ infected RBC intraperitoneally or 10⁶ infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as “in” if it overlaps the top or right lines and “out” if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the “red blood cell” option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.