Summary

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Published: January 03, 2011
doi:

Summary

Kemirgen sıtma parazitleri Genetik haçlar sivrisineklerin genetik olarak iki farklı parazitler besleyerek yapılmaktadır. Rekombinant döl sivrisinek enfekte farelerde ısırık izin sonra fare kandan klonlanmış. Bu video genetik haçlar üretmek nasıl gösterir<em> Plasmodium yoelii</em> Ve diğer kemirgen sıtma parazitleri için geçerlidir.

Abstract

Antimalaryal yanıt ve sıtma parazitleri, patojenite Varyasyon, biyolojik ve tıbbi önemi. Bağlantı haritalama 1-3 kemirgenler ve insanlarda 4-6 sıtma parazitleri çeşitli özelliklerin altında yatan gen veya lokusların başarılı tanımlanmasına yol açmıştır. Sıtma paraziti Plasmodium yoelii vahşi Afrika kemirgenler izole birçok sıtma türlerinin biridir ve laboratuvarlarda büyümeye adapte edilmiştir. Bu tür birçok insan sıtma parazitlerinin biyolojik özellikleri yeniden üretmesidir; parazit 7-9 mikrosatellit ve amplifiye parça uzunluk polimorfizmi (AFLP) işaretleyicileri gibi genetik belirteçleri için geliştirilmiştir. Böylece, kemirgen sıtma parazitleri Plasmodium falciparum araştırma tamamlamak için genetik çalışmalar yapılabilir. Burada, P. genetik bir çapraz üretmek için teknikler göstermektedir yoelii ilk kez Dr tarafından öncülük edilmiştir . David Walliker Richard Carter ve arkadaşları 10, Edinburgh Üniversitesi.

P. de Genetik haçlar yoelii ve diğer kemirgen sıtma parazitleri ilgi fenotipleri ve sivrisinek, 4 gün sonra enfeksiyon enfekte fareler üzerinde beslemek için izin vererek farklı genetik olarak farklı iki klonların gametocytes içeren bir inokulum ile enfekte fareler Mus musculus tarafından yapılmaktadır . Erkek ve dişi fare kan gametocytes varlığı mikroskobik beslemeden önce teyit edilir. Beslenmeden sonra 48 saat içinde, sivrisinek midgut, haploit gametocytes, erkek ve dişi eşey hücrelerinin içine ayırt döller ve diploid zigot formu (Şekil 1). Bir ookinete bir zigot gelişimi sırasında, mayoz 11. meydana görünür. Zigot genetik olarak farklı iki parazitler, genetik değişim (homolog kromozom çiftinin olmayan kardeş kromatidler arasında kromozomal reassortment ve cross-over; Şekil 2) gamet arasındaki çapraz döllenme yoluyla elde edilen ise, rekombinasyon sonuçlanan oluşabilir homolog lokusların genetik materyal. Her zigot dört haploit çekirdeklerin önde gelen, birbirini izleyen iki nükleer bölünmeler uğrar. Bir ookinete daha bir ookist içine geliştirir. Ookist olgunlaştıkça sonra, sporozoites (çapraz döl) binlerce oluşan ve sivrisinek hemoceal salınır. Sporozoites tükürük bezleri hasat öncesi eritrosit ve eritrosit aşama bir gelişme gerçekleşir yeni bir fare ev sahibi, içine enjekte edilir. Eritrosit formları klonlanmış ve genetik bağlantı haritalama önce ebeveyn hatları ayırt edici karakter bakımından sınıflandırılır. Bireysel ebeveyn klonların Kontrol enfeksiyonlar, genetik çapraz üretim olarak aynı şekilde yapılmaktadır.

Protocol

Farelere deneysel sonuçların bulandırabilir eksojen enfeksiyöz ajanların yanlışlıkla giriş önlemek için hayvanlar içine yönetilmektedir olacak bütün malzemeleri aseptik teknikler uygulanmalıdır. 1. Kan sahne Sıtma Parazitler Laboratuvar Fare Enfeksiyon Oda sıcaklığında çözünme, dondurulmuş kan sahne sıtma parazitleri içeren iki şişeleri geçilebilir. Bu örnekte, iki kemirgen sıtma paraziti suşları Plasmodium yoelii yoelii ve Plasmodiu…

Discussion

Biz, aynı zamanda diğer kemirgen malarias genetik haçlar üretimi için geçerli kemirgen sıtma Plasmodium yoelii, genetik bir haç üretim teknikleri göstermektedir. Tek ebeveyn klonları ile farelerin enfeksiyonları genellikle ebeveynlerin çapraz yapmadan önce fonksiyonel gamet üretiminde yetkin olmalarını sağlamak için ebeveyn parazitlerin başarılı iletim belirlemek için yapılmaktadır.

Başarılı bir sivrisinek yoluyla aktarımı insectary sıcaklığı, kulla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey Dan Pare ve Tovi Lehman el yazmaları eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu çalışma ve 973 Çin Ulusal Temel Araştırma Programı, # 2007CB513103 İntramural İntramural Araştırma Bölümü Araştırma Programı, Ulusal Enstitüsü Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir. NIAID intramural editörü Brenda Rae Marshall yardım için teşekkür ederim.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Glyerolyte 57 solution   Cenmed 4A7833  
Mouse Mus musculus   Charles River Laboratory   Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum   Invitrogen 26010-066  
Phosphate buffered saline (PBS) solution   Invitrogen 10010-072 pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium yoelii yoelii 17XNL(1.1)   MR4 MRA-593 deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium yoelii nigeriensis N67   MR4 MRA-427 deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi   MR4 MRA-128 deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter   Nexcelom Biosciences Cellometer Auto T4  
Cellometer CP2 disposable hemacytometer   Nexcelom Biosciences Cellometer CP2  
High Pure PCR template preparation kit   Roche Applied Science 11 796 828 001  
Calcium chloride   Sigma-Aldrich C5670 Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified   Sigma-Aldrich GS500  
Ketamine hydrochloride   Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride   Sigma-Aldrich P5405 Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride   Sigma-Aldrich S5886 Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate   Sigma-Aldrich S4641  
Xylazine   Akorn Inc. 4811-20ml Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool   VWR 32848-003  
Glass capillary (1 μL)   VWR 53440-001  
Hemocytometer   VWR 15170-168 Complete chamber set
Homogenizer   VWR KT749520-0090 Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

  • Maintenance of laboratory mice
  • Maintenance of laboratory mosquitoes
  • Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
  • Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquitoes

Mosquitoes are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium yoelii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquitoes are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as “in” if it overlaps the top or right lines and “out” if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the “red blood cell” option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.

References

  1. Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).
  2. Cravo, P. V. Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).
  3. Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved?. Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).
  4. Yuan, J. Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum. Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).
  5. Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa. Cell. 91, 593-603 (1997).
  6. Hayton, K. Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion. Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).
  7. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite. Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).
  8. Li, J. Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites. Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).
  9. Li, J. Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method. Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).
  10. Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. Genetic recombination in malaria parasites. Nature. 232, 561-562 (1971).
  11. Sinden, R. E., Hartley, R. H. Identification of the meiotic division of malarial parasites. J Protozool. 32, 742-744 (1985).
  12. Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. J Parasitol. 70, 831-833 (1984).
  13. Yoeli, M., Most, H., Bone, G. Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus. Science. 144, 1580-1581 (1964).
  14. Landau, I., Boulard, Y. . Life cycles and Morphology. , (1978).
  15. Vanderbergh, J. P. Y., M, . Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. J Parasitol. 52, 559-564 (1966).
  16. Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami. Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).
  17. Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. e. n. e. encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).
  18. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria. PLoS One. 2, e857-e857 (2007).
  19. Mackinnon, M. J., Read, A. F. Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi. Evolution. 53, 689-703 (1999).

Play Video

Cite This Article
Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).

View Video