Genetiska korsningar av parasiter gnagare malaria utförs genom att mata två genetiskt skilda parasiter till myggor. Rekombinant avkomma är klonade från mus blodet efter så att myggorna att bita infekterade möss. Denna video visar hur man kan producera genetiska korsningar av<em> Plasmodium yoelii</em> Och gäller andra parasiter gnagare malaria.
Variation i reaktion mot malariamedel och patogenicitet av malariaparasiter är av biologisk och medicinsk betydelse. Koppling kartläggning har lett till framgång i att identifiera gener eller loci bakom olika drag i malariaparasiter av gnagare 1-3 och människor 4-6. Malariaparasiten Plasmodium yoelii är en av många malaria arter isolerats från vilda afrikanska gnagare och har anpassats för att växa i laboratorier. Denna art återger många av de biologiska egenskaperna hos den mänskliga malariaparasiter, genetiska markörer som mikrosatellit och förstärkta fragmentet längd polymorfism (AFLP) markörer har också utvecklats för parasiten 7-9. Således kan genetiska studier i parasiter gnagare malaria utföras som ett komplement till forskning om Plasmodium falciparum. Här visar vi de tekniker för att producera en genetisk kors i P. yoelii som först uppfunnen av Dr. David Walliker, Richard Carter, och kollegor vid University of Edinburgh 10.
Genetisk kors i P. yoelii och andra gnagare malariaparasiter sker genom att infektera möss Mus musculus med ett inokulat som innehåller gametocyter av två genetiskt distinkta kloner som skiljer sig fenotyper av intresse och genom att låta myggor att livnära sig på den infekterade möss 4 dagar efter infektion. Förekomsten av manliga och kvinnliga gametocyter i musen blodet är mikroskopiskt bekräftas innan utfodring. Inom 48 timmar efter utfodring i midgut av mygga, det haploida gametocyter differentiera till manliga och kvinnliga könsceller, befrukta, och bilda en diploid zygot (bild 1). Under utvecklingen av en zygot till en ookinete verkar meios ske 11. Om zygoten framställs genom korsbefruktning mellan könsceller från två genetiskt skilda parasiter, genetisk utbyte (kromosomala reassortment och cross-overs mellan de icke-systerkromatider av ett par av homologa kromosomer,. Fig. 2) kan förekomma, vilket resulterar i rekombination av genetiskt material på homolog loci. Varje zygot genomgår två på varandra kärnvapen divisioner, vilket leder till fyra haploida kärnor. En ookinete utvecklas ytterligare i en oocyst. När oocyst mognar, tusentals sporozoites (avkomman av korset) bildas och släpps ut i mygga hemoceal. Sporozoites skördas från spottkörtlar och sprutas in i en ny mus värd, där pre-erytrocyt och erytrocyt stadiet utveckling sker. Erytrocyt former är klonade och klassificeras med avseende på tecken särskilja föräldralinjer innan genetisk koppling kartläggning. Bekämpa infektion av enskilda föräldrarnas kloner utförs på samma sätt som produktionen av en genetisk kors.
Vi visar tekniker för produktion av en genetisk kryss i gnagare malaria Plasmodium yoelii, som även gäller för produktionen av genetisk kors i andra gnagare malarias. Infektioner i möss med samma föräldrapenning kloner är vanligen utförs för att bestämma en framgångsrik överföring av föräldrarnas parasiter att se till att föräldrarna är kompetenta att producera funktionella könsceller innan du utför ett kors.
Framgångsrik överföring via en mygga påverkas av …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare och Tovi Lehman för kritisk läsning av manuskript. Detta arbete stöddes av Interna forskningsprogram Avdelningen för Interna Forskning, National Institute of Allergy och infektionssjukdomar, National Institutes of Health, och av 973 nationella Grundläggande forskningsprogram av Kina # 2007CB513103. Vi tackar NIAID intramural redaktör Brenda Rae Marshall för hjälp.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Glyerolyte 57 solution | Cenmed | 4A7833 | ||
Mouse Mus musculus | Charles River Laboratory | Female, inbred, strain Balb/C | ||
Heat-inactivated calf serum | Invitrogen | 26010-066 | ||
Phosphate buffered saline (PBS) solution | Invitrogen | 10010-072 | pH 7.4; Cell Culture grade | |
Malaria parasite Plasmodium yoelii yoelii 17XNL(1.1) | MR4 | MRA-593 | deposited by DJ Carucci | |
Malaria parasite Plasmodium yoelii nigeriensis N67 | MR4 | MRA-427 | deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick | |
Mosquito Anopheles stephensi | MR4 | MRA-128 | deposited by MQ Benedict | |
Cellometer automatic cell counter | Nexcelom Biosciences | Cellometer Auto T4 | ||
Cellometer CP2 disposable hemacytometer | Nexcelom Biosciences | Cellometer CP2 | ||
High Pure PCR template preparation kit | Roche Applied Science | 11 796 828 001 | ||
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Cell culture tested; insect cell culture tested | |
Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | GS500 | ||
Ketamine hydrochloride | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Cell culture tested; insect cell culture tested | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Cell culture tested; insect cell culture tested | |
Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | ||
Xylazine | Akorn Inc. | 4811-20ml | Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL | |
Glass wool | VWR | 32848-003 | ||
Glass capillary (1 μL) | VWR | 53440-001 | ||
Hemocytometer | VWR | 15170-168 | Complete chamber set | |
Homogenizer | VWR | KT749520-0090 | Pestle with matching tube, 1.5 mL |
SUPPLEMENTARY MATERIALS:
Maintenance of laboratory mice
Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).
Maintenance of laboratory mosquitoes
Mosquitoes are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium yoelii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquitoes are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.
Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously.
Measurement of red blood cell density
Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as “in” if it overlaps the top or right lines and “out” if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the “red blood cell” option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.