Test in vitro avec la méthylation de l'ADN ARNt avec Entamoeba histolytica et ARNt Dnmt2 méthyltransférase (Ehmeth) Enzyme
Summary
Ce protocole décrit la préparation d'un substrat synthétique pour l'ARNt<em> Entamoeba histolytica</em> ADN / ARNt méthyltransférase 2 (Dnmt2) Ehmeth homologue et la mesure de son activité méthyltransférase. Cette approche expérimentale peut être utilisée pour étudier l'activité d'autres protéines Dnmt2.
Abstract
Les parasites protozoaires sont parmi les agents infectieuses les plus dévastatrices de l'homme responsable d'une variété de maladies, notamment l'amibiase, qui est l'une des trois causes les plus fréquentes de décès par maladie parasitaire. L'agent de l'amibiase est l'amibe parasite Entamoeba histolytica qui existe sous deux étapes: le kyste infectieux présents dans les aliments ou l'eau et les vivants trophozoïte envahissantes dans l'intestin. Les manifestations cliniques de l'amibiase large d'être asymptomatique à la colite abcès, la dysenterie ou le foie. E. histolytica est l'un des rares du parasite unicellulaire, avec le 5-méthylcytosine (5mC) dans son génome. 1, 2 Il contient un ADN simple méthyltransférase, Ehmeth, qui appartient à la famille Dnmt2. 2 Un rôle pour Dnmt2 dans le contrôle des éléments répétitifs a été établi dans E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 et la drosophile. 6 Nos travaux récents ont montré que Ehmeth méthylates ARNt Asp, et cette constatation indique que cette enzyme a un ADN double / ARNt Asp activité méthyltransférase. 7 Cette observation est en accord avec la double activité qui a été rapporté pour D. discoideum et D. melanogaster. 8 La signification fonctionnelle de la spécificité ADN / ARNt de Dnmt2 enzymes est encore inconnue. Pour répondre à cette question, une méthode pour déterminer l'ARNt activité méthyltransférase d'Dnmt2 protéines a été établie. Dans cette vidéo, nous décrivons une approche simple pour préparer un substrat adéquat pour Dnmt2 ARNt et une méthode pour mesurer son activité ARNt méthyltransférase.
Protocol
Discussion
Dans cette présentation, nous avons illustré la façon de préparer des composants actifs pour la mesure de l'ARNt activité méthyltransférase de E. histolytica Ehmeth enzyme. Cette procédure peut servir comme point de départ et d'être facilement adapté à la mesure de l'ARNt méthyltransférases d'autres. Il est important de suivre les procédures qui permettent de préserver la qualité et l'intégrité du substrat ARNt et de l'ARNt méthyltransférase protéines pour assurer u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation d'Israël et de l'Institut des sciences familiales Rappaport pour la recherche en sciences médicales, et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
| NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
| Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
| Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
| Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
| Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
| Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
| Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
| BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
| Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
| TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
| Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
| DEPC | Sigma | D5758 | ||
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
| Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
| IPTG | Sigma | I6758 | ||
| PMSF | Sigma | P7626 | ||
| Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
| Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
| Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
| Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
| L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
| AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
- Banerjee, S., Fisher, O., Lohia, A., Ankri, S. Entamoeba histolytica DNA methyltransferase (Ehmeth) is a nuclear matrix protein that binds EhMRS2, a DNA that includes a scaffold/matrix attachment region (S/MAR). Mol Biochem Parasitol. 139, 91-97 (2005).
- Fisher, O., Siman-Tov, R., Ankri, S. Characterization of cytosine methylated regions and 5-cytosine DNA methyltransferase (Ehmeth) in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Nucleic Acids Res. 32, 287-297 (2004).
- Harony, H., Bernes, S., Siman-Tov, R., Ankri, S. DNA methylation and targeting of LINE retrotransposons in Entamoeba histolytica and Entamoeba invadens. Mol Biochem Parasitol. 147, 55-63 (2006).
- Kuhlmann, M. Silencing of retrotransposons in Dictyostelium by DNA methylation and RNAi. Nucleic Acids Res. 33, 6405-6417 (2005).
- Katoh, M. Developmentally regulated DNA methylation in Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 5, 18-25 (2006).
- Phalke, S. Retrotransposon silencing and telomere integrity in somatic cells of Drosophila depends on the cytosine-5 methyltransferase DNMT2. Nat Genet. 41, 696-702 (2009).
- Tovy, A., Siman Tov, R., Gaentzsch, R., Helm, M., Ankri, S. A new nuclear function of the Entamoeba histolytica glycolytic enzyme enolase: the metabolic regulation of cytosine-5 methyltransferase 2 (Dnmt2) activity. PLoS Pathog. 6, e1000775-e1000775 (2010).
- Jeltsch, A., Nellen, W., Lyko, F. Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases. Trends Biochem Sci. 31, 306-308 (2006).
- Fechter, P., Rudinger, J., Giege, R., Theobald-Dietrich, A. Ribozyme processed tRNA transcripts with unfriendly internal promoter for T7 RNA polymerase: production and activity. FEBS Lett. 436, 99-103 (1998).
- Hermann, A., Schmitt, S., Jeltsch, A. The human Dnmt2 has residual DNA-(Cytosine-C5)-methyltransferase activity. J Biol Chem. 278, 31717-31721 (2003).
- Narsa Reddy, M., Tang, L. Y., Lee, T. L., &, T. L., James Shen, C. K. A candidate gene for Drosophila genome methylation. Oncogene. 22, 6301-6303 (2003).
