Ensayo in vitro de metilación del ADN tRNA con Entamoeba histolytica y Dnmt2 tRNA metiltransferasa (Ehmeth) Enzima
Summary
Este protocolo describe la preparación de un sustrato sintético para el tRNA<em> Entamoeba histolytica</em> DNA / tRNA metiltransferasa 2 (Dnmt2) Ehmeth homólogo y la medida de su actividad metiltransferasa. Este enfoque experimental puede ser utilizado para investigar la actividad de otras proteínas Dnmt2.
Abstract
Parásitos protozoarios se encuentran entre los agentes infecciosos más devastadores de los seres humanos responsables de una variedad de enfermedades, incluyendo la amibiasis, la cual es una de las tres causas más comunes de muerte por enfermedades parasitarias. El agente de la amibiasis es la ameba Entamoeba histolytica parásito que existe en dos etapas: el quiste infeccioso en los alimentos o el agua y la vida trofozoíto invasivo en el intestino. Las manifestaciones clínicas de la amebiasis de ser asintomática hasta abscesos colitis, disentería o el hígado. E. histolytica es uno de los raros parásito unicelular con 5-metilcitosina (5mC) en su genoma. 1, 2 contiene un ADN único metiltransferasa, Ehmeth, que pertenece a la familia Dnmt2. 2 El papel de Dnmt2 en el control de elementos repetitivos se ha establecido en E. histolytica, 3 discoideum Dictyostelium 4,5 y Drosophila. 6 Nuestro trabajo reciente ha demostrado que Ehmeth metila tRNA Asp, y este hallazgo indica que esta enzima tiene un ADN de doble / tRNA Asp actividad metiltransferasa. 7 Esta observación está de acuerdo con la doble actividad que se ha informado de D. discoideum y D. melanogaster. 8 La importancia funcional de la especificidad ADN / tRNA de Dnmt2 enzimas es aún desconocido. Para abordar esta cuestión, un método para determinar la actividad de la metiltransferasa tRNA Dnmt2 proteínas se estableció. En este video, se describe un método sencillo para preparar un sustrato adecuado para el tRNA Dnmt2 y un método para medir su actividad tRNA metiltransferasa.
Protocol
Discussion
En esta presentación, se muestra cómo preparar los componentes activos de la medida de la actividad metiltransferasa tRNA de E. histolytica Ehmeth enzima. Este procedimiento puede servir como punto de partida y ser fácilmente adaptado a la medida de las metiltransferasas tRNA otros. Es importante seguir los procedimientos que permiten preservar la calidad y la integridad del sustrato tRNA y de la proteína tRNA metiltransferasa para asegurar una medida óptima de la actividad enzimática.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación de Israel Ciencia y el Instituto de la Familia Rappaport de Investigación en Ciencias Médicas, y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
| NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
| Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
| Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
| Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
| Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
| Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
| Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
| BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
| Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
| TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
| Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
| DEPC | Sigma | D5758 | ||
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
| Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
| IPTG | Sigma | I6758 | ||
| PMSF | Sigma | P7626 | ||
| Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
| Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
| Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
| Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
| L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
| AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
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