赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに
Summary
このプロトコルは、のための合成のtRNA基質の調製を記載し<em>赤痢アメーバ</em> DNA / tRNAのメチルトランスフェラーゼ2（Dnmt2）ホモログのEhmethとそのメチルトランスフェラーゼ活性の測定。この実験的なアプローチは、他のDnmt2タンパク質の活性を調べるために使用することができます。
Abstract
原生動物の寄生虫は寄生虫症による死亡の最も一般的な3つの原因のひとつであるアメーバ症、を含む種々の疾患を担当し、人間の最も破壊的な感染性病原体の一つです。食物や水で検出された感染性嚢胞と腸における侵襲栄養体の生活：アメーバ症のエージェントは2つのステージの下に存在するアメーバ原虫赤痢アメーバです。無症候性であることから大腸炎、赤痢や肝膿瘍のアメーバ症の範囲の臨床症状。E.赤痢は、そのゲノムの5 -メチルシトシン（5mC）との珍しい単細胞寄生虫の一つです。1、2、それはDnmt2ファミリーに属する単一のDNAメチルトランスフェラーゼ、Ehmethが、含まれている。2 Dnmt2の役割繰返し要素の制御にありE.年に設立されて赤痢 、3 キイロタマホコリカビ 4,5とショウジョウバエは 6我々の最近の仕事は、そのEhmethメチル化のtRNA Aspを示している、そしてこの発見は、この酵素は二重のDNA / tRNAのAspをメチルトランスフェラーゼ活性を有することを示しています。7この観察は、二重の活動と一致しているD.について報告されていることカビとD.キイロ 8 Dnmt2酵素のDNA / tRNAの特異性の機能的意義は依然として不明である。この問題に対処するために、Dnmt2タンパク質のtRNAメチルトランスフェラーゼ活性を決定する方法が確立されました。このビデオでは、我々はDnmt2ための十分なtRNAの基板を準備するために簡単なアプローチとそのtRNAのメチルトランスフェラーゼ活性を測定する方法を説明します。
Protocol
実験を開始する前に前提条件： RNaseフリー水はRNaseがによって分解されるRNAのリスクを軽減するために実験室でのRNAの処理で使用されています。この目的のために、水は通常37℃で少なくとも1時間、0.1％（v / v）のジエチルピロカーボネート（DEPC）で処理され° C、次にDEPCの跡を不活化する（少なくとも15分）オートクレーブ。 Pipetmanピペットを使用する前にRNaseの除染液（RNase?…
Discussion
本発表では、我々はE.のtRNAメチルトランスフェラーゼ活性の測定のためにアクティブコンポーネントを準備する方法を説明赤痢 Ehmeth酵素。この手順では、出発点として利用することもできますし、簡単に他のtRNAメチルトランスフェラーゼの測定に適応させる。酵素活性の最適な測定を保証するために、tRNAの基質のとtRNAメチルトランスフェラーゼ蛋白質の品質と整合性を維持す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究では、イスラエル科学財団と医科学の研究のためのラパポートファミリー研究所、およびドイツ学術振興協会（DFG）からの補助金によって支えられている。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
| NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
| Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
| Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
| Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
| Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
| Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
| Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
| BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
| Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
| TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
| Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
| DEPC | Sigma | D5758 | ||
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
| Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
| IPTG | Sigma | I6758 | ||
| PMSF | Sigma | P7626 | ||
| Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
| Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
| Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
| Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
| L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
| AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
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Tags
In Vitro TRNA Methylation AssayEntamoeba HistolyticaDNA Methyltransferase Dnmt2Ehmeth EnzymeProtozoan ParasitesAmebiasisInfectious AgentsClinical Manifestations5-methylcytosine (5mC)Single DNA MethyltransferaseControl Of Repetitive ElementsDual DNA/tRNAAsp Methyltransferase ActivityFunctional SignificanceTRNA Methyltransferase ActivityDnmt2 Proteins
Cite This Article
Tovy, A., Hofmann, B., Helm, M., Ankri, S. In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme. J. Vis. Exp. (44), e2390, doi:10.3791/2390 (2010).