एटामोइबा हिस्टोलिटिका डीएनए और tRNA मिथाइल Dnmt2 एनजाइम (Ehmeth) के साथ इन विट्रो tRNA मेथिलिकरण परख
Summary
इस प्रोटोकॉल के लिए एक कृत्रिम tRNA सब्सट्रेट की तैयारी का वर्णन<em> एटामोइबा हिस्टोलिटिका</em> डीएनए / tRNA मिथाइल 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth और अपनी मिथाइल गतिविधि के उपाय. इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण अन्य Dnmt2 प्रोटीन की गतिविधि की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
प्रोटोजोआ परजीवी amebiasis, जो एक परजीवी रोग से तीन सबसे आम मृत्यु के कारणों की है सहित रोगों की एक किस्म के लिए जिम्मेदार इंसानों की सबसे विनाशकारी संक्रामक एजेंटों के बीच हैं. amebiasis के एजेंट अमीबा परजीवी एटामोइबा हिस्टोलिटिका कि दो चरणों के तहत मौजूद है: संक्रामक पुटी भोजन या पानी आंत में और आक्रामक trophozoite रहने वाले में पाया . स्पर्शोन्मुख जा रहा से बृहदांत्रशोथ, पेचिश, या जिगर फोड़े amebiasis रेंज के नैदानिक अभिव्यक्तियाँ ई. . हिस्टोलिटिका 5 मिथाइलसिटोसाइन (5mC) के साथ अपने जीनोम में एक दुर्लभ कोशिकीय परजीवी के 1, 2. इसमें एक मिथाइल डीएनए, Ehmeth, कि Dnmt2 परिवार के लिए है. 2 Dnmt2 के लिए दोहराए तत्वों के नियंत्रण में एक भूमिका है ई. में स्थापित किया गया हिस्टोलिटिका, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 और ड्रोसोफिला. 6 हमारी हाल ही में काम दिखाया गया है कि Ehmeth methylates tRNA Asp, और इस खोज इंगित करता है कि यह एंजाइम एक दोहरी / डीएनए tRNA Asp मिथाइल गतिविधि है. 7 इस अवलोकन दोहरी गतिविधि के साथ समझौते में है कि डी. के लिए सूचित किया गया है discoideum और डी. मेलानोगास्टर. 8 की विशिष्टता Dnmt2 एंजाइमों डीएनए / tRNA के कार्यात्मक महत्व अभी भी अज्ञात है है . इस सवाल का पता करने के लिए, विधि Dnmt2 प्रोटीन tRNA मिथाइल गतिविधि निर्धारित स्थापित किया गया था. इस वीडियो में, हम एक सरल Dnmt2 के लिए एक पर्याप्त tRNA सब्सट्रेट तैयार दृष्टिकोण और अपने tRNA मिथाइल गतिविधि को मापने की विधि का वर्णन.
Protocol
Discussion
इस प्रस्तुति में, हम सचित्र ई. के tRNA मिथाइल गतिविधि के उपाय के लिए सक्रिय घटकों को कैसे तैयार करने के लिए हिस्टोलिटिका Ehmeth एंजाइम. इस प्रक्रिया के एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा और अन्य tRNA methyltransferase…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन इसराइल विज्ञान फाउंडेशन और चिकित्सा विज्ञान में अनुसंधान के लिए Rappaport परिवार संस्थान, और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
| NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
| Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
| Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
| Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
| Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
| Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
| Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
| BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
| Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
| TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
| Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
| DEPC | Sigma | D5758 | ||
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
| Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
| IPTG | Sigma | I6758 | ||
| PMSF | Sigma | P7626 | ||
| Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
| Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
| Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
| Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
| L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
| AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
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