In vitro-tRNA Metylering Analysera med Entamoeba histolytica DNA och tRNA metyltransferas Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme
Summary
Detta protokoll beskriver förberedelserna av ett syntetiskt tRNA substrat för den<em> Entamoeba histolytica</em> DNA / tRNA metyltransferas 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth och mått på dess metyltransferas aktivitet. Denna experimentella metod kan användas för att undersöka aktiviteten hos andra Dnmt2 proteiner.
Abstract
Protozo parasiter är bland de mest förödande infektioner av människor med ansvar för en rad olika sjukdomar, bland annat amebiasis, som är en av de tre vanligaste dödsorsakerna från parasitsjukdom. Agenten av amebiasis är amöba parasit Entamoeba histolytica som finns i två steg: det smittsamma cysta som finns i mat eller vatten och invasiva trophozoite lever i tarmen. Den kliniska manifestationer av amebiasis variera från att vara asymtomatiska till kolit, dysenteri eller lever abscesser. E. histolytica är en av de få encelliga parasiten med 5-methylcytosine (5mC) i sin arvsmassa. 1, 2 Det innehåller en enda DNA-metyltransferas, Ehmeth, som tillhör Dnmt2 familjen. 2 En roll för Dnmt2 i kontrollen av repetitiva element har fastställts i E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 och Drosophila. 6 Vårt senaste arbete har visat att Ehmeth methylates tRNA Asp, och detta fynd tyder på att detta enzym har en dubbel DNA / tRNA Asp metyltransferas aktivitet. 7 Detta konstaterande är i överensstämmelse med den dubbla verksamheten som har rapporterats för D. discoideum och D. melanogaster. 8 Den funktionella betydelsen av DNA / tRNA-specificiteten hos Dnmt2 enzymer är fortfarande okänd. För att lösa denna fråga, var en metod för att bestämma tRNA metyltransferas aktivitet Dnmt2 proteiner fastställts. I denna video beskriver vi en okomplicerad metod för att förbereda en lämplig tRNA substrat för Dnmt2 och en metod för att mäta sin tRNA metyltransferas aktivitet.
Protocol
Discussion
I denna presentation illustrerade vi hur man förbereder aktiva komponenter för mätning av tRNA metyltransferas aktivitet E. histolytica Ehmeth enzym. Detta förfarande kan fungera som en utgångspunkt och lätt anpassas till åtgärden av andra tRNA metyltransferaser. Det är viktigt att följa de förfaranden som bevarar kvaliteten och integriteten i tRNA-substrat och tRNA metyltransferas protein för att försäkra en optimal mått på den enzymatiska aktiviteten.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie har finansierats med bidrag från Israel Science Foundation och Rappaport Familj Institutet för forskning inom medicinska vetenskaper, och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
| NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
| Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
| Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
| Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
| Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
| Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
| Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
| BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
| Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
| TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
| Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
| DEPC | Sigma | D5758 | ||
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
| Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
| IPTG | Sigma | I6758 | ||
| PMSF | Sigma | P7626 | ||
| Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
| Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
| Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
| Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
| L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
| AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
- Banerjee, S., Fisher, O., Lohia, A., Ankri, S. Entamoeba histolytica DNA methyltransferase (Ehmeth) is a nuclear matrix protein that binds EhMRS2, a DNA that includes a scaffold/matrix attachment region (S/MAR). Mol Biochem Parasitol. 139, 91-97 (2005).
- Fisher, O., Siman-Tov, R., Ankri, S. Characterization of cytosine methylated regions and 5-cytosine DNA methyltransferase (Ehmeth) in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Nucleic Acids Res. 32, 287-297 (2004).
- Harony, H., Bernes, S., Siman-Tov, R., Ankri, S. DNA methylation and targeting of LINE retrotransposons in Entamoeba histolytica and Entamoeba invadens. Mol Biochem Parasitol. 147, 55-63 (2006).
- Kuhlmann, M. Silencing of retrotransposons in Dictyostelium by DNA methylation and RNAi. Nucleic Acids Res. 33, 6405-6417 (2005).
- Katoh, M. Developmentally regulated DNA methylation in Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 5, 18-25 (2006).
- Phalke, S. Retrotransposon silencing and telomere integrity in somatic cells of Drosophila depends on the cytosine-5 methyltransferase DNMT2. Nat Genet. 41, 696-702 (2009).
- Tovy, A., Siman Tov, R., Gaentzsch, R., Helm, M., Ankri, S. A new nuclear function of the Entamoeba histolytica glycolytic enzyme enolase: the metabolic regulation of cytosine-5 methyltransferase 2 (Dnmt2) activity. PLoS Pathog. 6, e1000775-e1000775 (2010).
- Jeltsch, A., Nellen, W., Lyko, F. Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases. Trends Biochem Sci. 31, 306-308 (2006).
- Fechter, P., Rudinger, J., Giege, R., Theobald-Dietrich, A. Ribozyme processed tRNA transcripts with unfriendly internal promoter for T7 RNA polymerase: production and activity. FEBS Lett. 436, 99-103 (1998).
- Hermann, A., Schmitt, S., Jeltsch, A. The human Dnmt2 has residual DNA-(Cytosine-C5)-methyltransferase activity. J Biol Chem. 278, 31717-31721 (2003).
- Narsa Reddy, M., Tang, L. Y., Lee, T. L., &, T. L., James Shen, C. K. A candidate gene for Drosophila genome methylation. Oncogene. 22, 6301-6303 (2003).
