Respirometrische oxidatieve fosforylering Assessment in Saponin-gepermeabiliseerde Cardiac Vezels
Summary
Saponine-gepermeabiliseerde vezels voorbereiding in combinatie met respirometrische oxidatieve fosforylering analyse geeft integratieve beoordeling van de mitochondriale functie. Mitochondriale ademhaling in fysiologische en pathologische toestanden kan weerspiegelen verschillende regelgevende invloeden waaronder mitochondriale interacties, morfologie en biochemie.
Abstract
Onderzoek van mitochondriale functie is een belangrijke parameter van de cardiale fysiologie als mitochondriën betrokken zijn bij energie-metabolisme, oxidatieve stress, apoptose, veroudering, mitochondriale encephalomyopathies en drugs toxiciteit. Gezien deze, technologieën om cardiale mitochondriale functie te meten zijn in de vraag. Een techniek die een geïntegreerde benadering maakt gebruik van op maat mitochondriale functie is respirometrische oxidatieve fosforylering (OXPHOS) analyse.
Het principe van respirometrische OXPHOS beoordeling is gecentreerd rond het meten van zuurstof met behulp van een Clark-elektrode. Omdat de gepermeabiliseerde vezelbundel verbruikt zuurstof, zuurstof-concentratie in de gesloten kamer af. Met behulp van geselecteerde substraat-remmer-ontkoppelrail titratie protocollen, worden elektronen verstrekt aan specifieke plaatsen van het elektron transport keten, waardoor de evaluatie van de mitochondriale functie. Voorafgaand aan respirometrische analyse van de mitochondriale functie, mechanische en chemische voorbereidende technieken worden gebruikt om de sarcolemma van spiervezels permeabilize. Chemische permeabilisatie heeft saponine om selectief te perforeren het celmembraan met behoud van mobiele architectuur.
Dit document beschrijft uitvoerig de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van saponine huid cardiale vezels voor zuurstofverbruik metingen om mitochondriale OXPHOS te evalueren. Bovendien, het oplossen van problemen advies evenals specifieke substraten, remmers en uncouplers die kunnen worden gebruikt om de mitochondriën functioneren vast te stellen op specifieke plaatsen van het elektron transport keten geleverd. Belangrijk is, kan de beschreven protocol eenvoudig worden toegepast op hart-en skeletspieren weefsel van verschillende diermodellen en menselijke monsters.
Protocol
Discussion
De saponine-gepermeabiliseerde cardiale fiber techniek biedt een uniek compromis tussen in vitro en in vivo evaluatie van de mitochondriale OXPHOS zuurstof verbruik. Voordelen van deze techniek zijn onder meer fysiologische relevantie in vergelijking met geïsoleerde mitochondria als cellulaire architectuur is bewaard gebleven. Terwijl de plasmamembraan is afgebroken, intracellulaire membraan structuren met inbegrip van mitochondria 12, 14, 14 sarcoplasmatisch reticulum, myofilamenten en het…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research en Genome Canada. JS houdt salaris ondersteuning awards van de Alberta Heritage Foundation voor Medisch Onderzoek, Hart en Stroke Foundation van Canada en de Canadese Diabetes Association. Het laboratorium wil de technische bijstand van Oroboros Instruments te erkennen tijdens de overname van de saponine-gepermeabiliseerde glasvezel techniek.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | ||
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma | A5285 | ||
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma | A-6003 | ||
| Antimycin A | Sigma | A8674 | ||
| Ascobic acid | Sigma | A4403 | ||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | ||
| Atractyloside | Sigma | A6882 | ||
| Calcium carbonate | Sigma | C4830 | ||
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Cytochrome c | Sigma | C7752 | ||
| Digitonin | Sigma | D141 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D9779 | ||
| Ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | ||
| Glutamic acid | Sigma | 27647 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| Imidazole | Sigma | I5513 | ||
| Ketamine | Pfizer | Ketaset | ||
| Lactobionic acid | Sigma | 153516 | ||
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M9272 | ||
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma | M9272 | ||
| Malic acid | Sigma | M1000 | ||
| MES | Sigma | M3671 | ||
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma | T3134 | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | ||
| Potassium Hydroxide | Sigma | P5958 | ||
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Rotenone | Sigma | R8875 | ||
| Saponin | Sigma | 47036 | ||
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| Succinic acid | Sigma | S3674 | ||
| Sucrose | Sigma | S7903 | ||
| Taurine | Sigma | T8691 | ||
| Xylazine | Bayer | Rompun | ||
| ddH2O | ||||
| Ice | ||||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | |||
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | ||
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-368 | ||
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-364 | ||
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | ||
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | ||
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | ||
| Sterile Surgical Blade | VWR | BD371610 | ||
| 0.45-μm Syringe filters | VWR | CA28145-485 | ||
| pH meter | VWR | CA11388-308 | ||
| Glass Petri dishes | VWR | 89000-300 | ||
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR | 82050-926 | ||
| Plate Stirrer | VWR | 97042-594 | ||
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | ||
| Weigh Scale | VWR | CA11278-162 | ||
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | ||
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | ||
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | ||
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | ||
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR | 89106-750 | ||
| Dissecting Microscope | Olympus |
References
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S., Heldmaier, G., Klingenspor, M. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. , 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e., Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 .
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O’Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 .
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, . Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T., Morad, M. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. , 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R., Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. , 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E., Dykens, J., Will, Y. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. , 327-352 (2008).
