Saponin – permeabilized respirometric oxidative phosphorylation विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में फाइबर की तैयारी mitochondrial समारोह के एकीकृत मूल्यांकन प्रदान करता है. शारीरिक और रोग राज्यों में mitochondrial श्वसन mitochondrial बातचीत, आकृति विज्ञान और जैव रसायन सहित विभिन्न नियामक प्रभावों को प्रतिबिंबित कर सकते हैं.
Mitochondrial समारोह की जांच हृदय शरीर क्रिया विज्ञान के एक महत्वपूर्ण पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में ऊर्जा चयापचय, oxidative तनाव, apoptosis, उम्र बढ़ने, mitochondrial encephalomyopathies और दवा विषाक्तता में mitochondria शामिल हैं. यह देखते हुए, हृदय mitochondrial समारोह को मापने के लिए प्रौद्योगिकियों की मांग कर रहे हैं. एक तकनीक है कि mitochondrial समारोह को मापने के लिए एक एकीकृत दृष्टिकोण को रोजगार respirometric oxidative phosphorylation विश्लेषण (OXPHOS) है.
respirometric OXPHOS मूल्यांकन के सिद्धांत क्लार्क इलेक्ट्रोड का उपयोग ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने के आसपास केंद्रित है. Permeabilized फाइबर बंडल के रूप में बंद कक्ष में गिरावट ऑक्सीजन, ऑक्सीजन एकाग्रता की खपत. चयनित सब्सट्रेट – अवरोध करनेवाला – uncoupler अनुमापन प्रोटोकॉल का प्रयोग, इलेक्ट्रॉनों इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के विशिष्ट साइटों के लिए प्रदान की जाती हैं, mitochondrial समारोह के मूल्यांकन की अनुमति है. Mitochondrial समारोह के respirometric विश्लेषण से पहले, यांत्रिक और रासायनिक तैयारी तकनीक का उपयोग कर रहे हैं मांसपेशी फाइबर के sarcolemma permeabilize. रासायनिक permeabilization सैपोनिन रोजगार के चुनिंदा कोशिका झिल्ली छेदना जबकि सेलुलर वास्तुकला को बनाए रखने.
इस कागज को अच्छी तरह से ऑक्सीजन की खपत के मापन के लिए सैपोनिन चमड़ी हृदय फाइबर की तैयारी mitochondrial OXPHOS का मूल्यांकन करने में शामिल कदम का वर्णन करता है. इसके अतिरिक्त, विशिष्ट substrates के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सलाह समस्या निवारण की आवश्यकता है, inhibitors और uncouplers कि इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के विशिष्ट स्थलों पर mitochondria समारोह का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान की जाती हैं. महत्वपूर्ण बात, वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से विभिन्न पशु मॉडल और मानव नमूनों के हृदय और कंकाल ऊतक के लिए लागू किया जा सकता है.
सैपोनिन permeabilized हृदय फाइबर तकनीक और mitochondrial OXPHOS ऑक्सीजन की खपत के vivo मूल्यांकन में इन विट्रो में के बीच एक अद्वितीय समझौता प्रदान करता है . इस तकनीक का लाभ सेलुलर वास्तुकला के रूप में अलग mitochondria की तुलना म?…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन के स्वास्थ्य अनुसंधान और जीनोम कनाडा कनाडा के संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था. जे एस वेतन चिकित्सा अनुसंधान, हार्ट और कनाडा के स्ट्रोक फाउंडेशन और कनाडा डायबिटीज एसोसिएशन के लिए अलबर्टा विरासत फाउंडेशन से समर्थन पुरस्कार रखती है. प्रयोगशाला फाइबर सैपोनिन permeabilized तकनीक के अधिग्रहण के दौरान Oroboros उपकरण की तकनीकी सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | ||
70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | ||
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma | A5285 | ||
Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma | A-6003 | ||
Antimycin A | Sigma | A8674 | ||
Ascobic acid | Sigma | A4403 | ||
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | ||
Atractyloside | Sigma | A6882 | ||
Calcium carbonate | Sigma | C4830 | ||
Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
Cytochrome c | Sigma | C7752 | ||
Digitonin | Sigma | D141 | ||
Dithiothreitol | Sigma | D9779 | ||
Ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | ||
Glutamic acid | Sigma | 27647 | ||
HEPES | Sigma | H4034 | ||
Imidazole | Sigma | I5513 | ||
Ketamine | Pfizer | Ketaset | ||
Lactobionic acid | Sigma | 153516 | ||
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M9272 | ||
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma | M9272 | ||
Malic acid | Sigma | M1000 | ||
MES | Sigma | M3671 | ||
N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma | T3134 | ||
Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ||
Potassium Chloride | Sigma | P9541 | ||
Potassium Hydroxide | Sigma | P5958 | ||
Potassium cyanide | Fluka | 60178 | ||
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
Rotenone | Sigma | R8875 | ||
Saponin | Sigma | 47036 | ||
Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
Succinic acid | Sigma | S3674 | ||
Sucrose | Sigma | S7903 | ||
Taurine | Sigma | T8691 | ||
Xylazine | Bayer | Rompun | ||
ddH2O | ||||
Ice | ||||
Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | |||
Kimwipes | VWR | 21905-026 | ||
15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-368 | ||
50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-364 | ||
Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | ||
Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | ||
Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | ||
Sterile Surgical Blade | VWR | BD371610 | ||
0.45-μm Syringe filters | VWR | CA28145-485 | ||
pH meter | VWR | CA11388-308 | ||
Glass Petri dishes | VWR | 89000-300 | ||
12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR | 82050-926 | ||
Plate Stirrer | VWR | 97042-594 | ||
Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | ||
Weigh Scale | VWR | CA11278-162 | ||
10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | ||
25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | ||
50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | ||
Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | ||
Polystyrene Weighing Dishes | VWR | 89106-750 | ||
Dissecting Microscope | Olympus |