Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere
Summary
Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do ensaio neurosphere para o isolamento e expansão de células-tronco neurais do eminências ganglionares do dia 14 de embriões de rato-cérebro.
Abstract
Em mamíferos, as células-tronco atua como uma fonte de células indiferenciadas para manter gênese ea renovação celular em diferentes tecidos e órgãos, durante o tempo de vida do animal. Eles podem potencialmente substituir as células que são perdidas no processo de envelhecimento ou em processo de lesão e doença. A existência de células-tronco neurais (NSCs) foi primeiramente descrita por Reynolds e Weiss (1992) no adulto sistema central de mamíferos nervoso central (SNC), utilizando um novo sistema de cultura sem soro, o ensaio neurosphere (NSA). Com este ensaio, também é possível isolar e ampliar NSCs de diferentes regiões do SNC embrionárias. Estes, NSCs vitro expandidas são multipotentes e podem dar origem aos três principais tipos de células do SNC. Enquanto a NSA parece relativamente simples de executar, atenção para os procedimentos demonstrado aqui é necessário para alcançar resultados confiáveis e consistentes. Este vídeo demonstra praticamente NSA para gerar e expandir NSCs partir do dia 14 de embriões de rato-tecido cerebral e fornece detalhes técnicos para que se possa atingir culturas neurosphere reprodutível. O procedimento inclui a colheita E14 embriões de camundongos, microdissecção cérebro para colher as eminências ganglionares, a dissociação do tecido colhido em meio NSC para ganhar uma suspensão de células individuais, e, finalmente, cultivo de células em cultura NSA. Depois de 5-7 dias em cultura, o que resulta neurospheres primários são várias passagens para expandir ainda mais o número do NSCs para futuros experimentos.
Protocol
Discussion
O ensaio neurosphere é o método de escolha para o isolamento e expansão de células-tronco neurais 05/01 devido à sua simplicidade e reprodutibilidade. Este ensaio é uma ferramenta inestimável para a geração em larga escala de células indiferenciadas células do SNC precursor, o que poderia ser usado para ambos in vitro e in vivo. Deve ser enfatizado que neurospheres poderiam ser gerados a partir de ambos os bona fide células-tronco neurais e progenitores mais restrito. Portanto, o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo financiamento da Fundação Overstreet.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Percision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. e. y. n. o. l. d. s. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
