Создание эмбриональных Мышь нейронные культуры стволовых клеток Использование Neurosphere Пробирной
Summary
Это видео демонстрирует протокол применения neurosphere тест для изоляции и расширения нервные стволовые клетки из ганглиозные возвышения эмбриональных день 14-мозга мыши.
Abstract
В млекопитающих, стволовые клетки действует как источник недифференцированных клеток для поддержания генезисе клеток и восстановление в различных тканях и органах в течение жизни животного. Они могут потенциально заменить клетки, которые теряются в процессе старения или в процессе получения травмы и болезни. Существование нервные стволовые клетки (NSCs) впервые был описан Рейнольдса и Вайса (1992) у взрослых млекопитающих, центральной нервной системы (ЦНС), используя новые бессывороточной культуре системы, neurosphere анализа (NSA). С помощью этого теста, это также возможно, чтобы изолировать и расширить NSCs из разных регионов эмбриональных ЦНС. Это, в пробирке NSCs расширяемых мультипотентных и может привести к трем основным типам клеток центральной нервной системы. Хотя АНБ кажется относительно прост в исполнении, внимание к процедурам продемонстрировали здесь требуется для достижения надежных и устойчивых результатов. Это видео демонстрирует практически АНБ для создания и расширения NSCs из эмбриональных день 14-мышь мозговой ткани и содержит техническую информацию, таким образом можно достичь воспроизводимых культур neurosphere. Процедура включает в себя уборка E14 эмбрионов мышей, мозг микродиссекции собрать ганглиозные возвышения, диссоциация собрано ткани в среде НСК для получения суспензии отдельных клеток и, наконец, покрытие клеток в культуре АНБ. После 5-7 дней в культуре, в результате первичного нейросферы являются пассировали для дальнейшего расширения числа NSCs для будущих экспериментов.
Protocol
Discussion
Neurosphere анализ является методом выбора для изоляции и расширения нервные стволовые клетки 1-5 из-за своей простоты и воспроизводимости. Этот анализ является бесценным инструментом для крупномасштабных поколения недифференцированных предшественников нервной клетки, которые могу…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансирование из Оверстрит Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Percision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. e. y. n. o. l. d. s. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
