Это видео демонстрирует протокол применения neurosphere тест для изоляции и расширения нервные стволовые клетки из ганглиозные возвышения эмбриональных день 14-мозга мыши.
Abstract
В млекопитающих, стволовые клетки действует как источник недифференцированных клеток для поддержания генезисе клеток и восстановление в различных тканях и органах в течение жизни животного. Они могут потенциально заменить клетки, которые теряются в процессе старения или в процессе получения травмы и болезни. Существование нервные стволовые клетки (NSCs) впервые был описан Рейнольдса и Вайса (1992) у взрослых млекопитающих, центральной нервной системы (ЦНС), используя новые бессывороточной культуре системы, neurosphere анализа (NSA). С помощью этого теста, это также возможно, чтобы изолировать и расширить NSCs из разных регионов эмбриональных ЦНС. Это, в пробирке NSCs расширяемых мультипотентных и может привести к трем основным типам клеток центральной нервной системы. Хотя АНБ кажется относительно прост в исполнении, внимание к процедурам продемонстрировали здесь требуется для достижения надежных и устойчивых результатов. Это видео демонстрирует практически АНБ для создания и расширения NSCs из эмбриональных день 14-мышь мозговой ткани и содержит техническую информацию, таким образом можно достичь воспроизводимых культур neurosphere. Процедура включает в себя уборка E14 эмбрионов мышей, мозг микродиссекции собрать ганглиозные возвышения, диссоциация собрано ткани в среде НСК для получения суспензии отдельных клеток и, наконец, покрытие клеток в культуре АНБ. После 5-7 дней в культуре, в результате первичного нейросферы являются пассировали для дальнейшего расширения числа NSCs для будущих экспериментов.
Protocol
1. Основные настройки Прежде чем приступить к Препарирование: Соответствующие объемы полной среде НСК получают путем смешивания NeuroCult НСК базальной среды и NeuroCult НСК распространения дополнений в 9:01 отношения, соответственно. Средний разогревается в 37 ° С водяной бане. ?…
Discussion
Neurosphere анализ является методом выбора для изоляции и расширения нервные стволовые клетки 1-5 из-за своей простоты и воспроизводимости. Этот анализ является бесценным инструментом для крупномасштабных поколения недифференцированных предшественников нервной клетки, которые могу…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансирование из Оверстрит Foundation.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
NeuroCult NSC Basal Medium
Medium
Stem Cell Technologies
05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements
Medium supplement
Stem Cell Technologies
05701
%0.05 trypsin-EDTA
Reagent
Gibco
25300-062
Soybean trypsin inhibitor
Reagent
Sigma
T6522
Pen/Strep
Reagent
Gibco
15140-122
*MEM
Reagent
Gibco
41500-018
HEM component
*HEPES
Reagent
Sigma
H4034
HEM component
*Distilled water
Reagent
Gibco
15230-147
Cell strainer
Sieve
BD Falcon
352340
T25 flask
Culture ware
Nalge Nunc international
136196
T80 flask
Culture ware
Nalge Nunc international
178905
15 ml tubes
Culture ware
BD Falcon
352096
50 ml tubes
Culture ware
BD Falcon
352070
Fine curved forceps
Surgical tools
Fine Science Tools
11251‐35
Small fine forceps
Surgical tools
Fine Science Tools
11272‐30
Small forceps
Surgical tools
Fine Science Tools
11050‐10
Fine scissors
Surgical tools
World Percision Instruments, Inc.
500216
EGF
Growth factor
R&D
2028-EG
b-FGF
Growth factor
R&D
3139-FB
Heparin
Growth factor
Sigma
H4784
Reconstituted in PBS
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457, doi:10.3791/2457 (2011).