تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere
Summary
فيديو يوضح هذا البروتوكول تطبيق مقايسة neurosphere للعزلة والتوسع من الخلايا الجذعية العصبية من الفضيلة العقدية من اليوم 14 الفأر الجنينية الدماغ.
Abstract
في mammalians ، والخلايا الجذعية تعمل كمصدر للخلايا غير متمايزة للحفاظ على نشأة وتجديد الخلايا في الأنسجة المختلفة وأجهزة خلال فترة حياة الحيوان. فإنها يمكن أن تحل محل الخلايا التي يحتمل أن تضيع في عملية الشيخوخة أو في عملية الاصابة والمرض. وكان أول وصف وجود الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) بواسطة رينولدز وفايس (1992) في النظام العصبي المركزي الثدييات الكبار (CNS) باستخدام نظام رواية ثقافة المصل الحرة ، ومقايسة neurosphere (NSA). باستخدام هذا الاختبار ، بل هو أيضا من المجدي عزل وتوسيع NSCs من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي الجنينية. في هذه NSCs توسيع المختبر وmultipotent ويمكن أن تؤدي إلى ثلاثة أنواع رئيسية من خلايا الجهاز العصبي المركزي. في حين أن وكالة الأمن القومي يبدو بسيطا نسبيا للتنفيذ ، الانتباه إلى إجراءات أثبتت هنا هو مطلوب من أجل تحقيق نتائج موثوقة ومتسقة. هذا الفيديو يوضح عمليا لتوليد وكالة الامن القومي وتوسيع NSCs من يوم 14 الفأر الجنينية أنسجة المخ ، ويقدم التفاصيل التقنية لذلك يمكن للمرء أن تحقيق الثقافات neurosphere استنساخه. الإجراء يشمل حصاد أجنة الفئران E14 ، microdissection الدماغ لحصاد البوارز العقدية ، تفكك النسيج المقطوع في مجلس الأمن القومي المتوسطة للحصول على تعليق خلية واحدة ، وأخيرا طلاء الخلايا في ثقافة وكالة الامن القومي. بعد 5-7 أيام في الثقافة ، هي في passaged neurospheres الناتجة الأولية لتوسيع عدد NSCs للتجارب المستقبلية.
Protocol
Discussion
في مقايسة neurosphere هو الأسلوب المفضل لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية 1-5 بسبب بساطته والتكاثر. هذا الاختبار هو أداة لا تقدر بثمن على نطاق واسع جيل من خلايا غير متمايزة CNS السلائف ، والتي يمكن استخدامها على حد سواء في التجارب المختبرية والدراسات المجراة.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة Overstreet.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Percision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. e. y. n. o. l. d. s. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
