فيديو يوضح هذا البروتوكول تطبيق مقايسة neurosphere للعزلة والتوسع من الخلايا الجذعية العصبية من الفضيلة العقدية من اليوم 14 الفأر الجنينية الدماغ.
Abstract
في mammalians ، والخلايا الجذعية تعمل كمصدر للخلايا غير متمايزة للحفاظ على نشأة وتجديد الخلايا في الأنسجة المختلفة وأجهزة خلال فترة حياة الحيوان. فإنها يمكن أن تحل محل الخلايا التي يحتمل أن تضيع في عملية الشيخوخة أو في عملية الاصابة والمرض. وكان أول وصف وجود الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) بواسطة رينولدز وفايس (1992) في النظام العصبي المركزي الثدييات الكبار (CNS) باستخدام نظام رواية ثقافة المصل الحرة ، ومقايسة neurosphere (NSA). باستخدام هذا الاختبار ، بل هو أيضا من المجدي عزل وتوسيع NSCs من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي الجنينية. في هذه NSCs توسيع المختبر وmultipotent ويمكن أن تؤدي إلى ثلاثة أنواع رئيسية من خلايا الجهاز العصبي المركزي. في حين أن وكالة الأمن القومي يبدو بسيطا نسبيا للتنفيذ ، الانتباه إلى إجراءات أثبتت هنا هو مطلوب من أجل تحقيق نتائج موثوقة ومتسقة. هذا الفيديو يوضح عمليا لتوليد وكالة الامن القومي وتوسيع NSCs من يوم 14 الفأر الجنينية أنسجة المخ ، ويقدم التفاصيل التقنية لذلك يمكن للمرء أن تحقيق الثقافات neurosphere استنساخه. الإجراء يشمل حصاد أجنة الفئران E14 ، microdissection الدماغ لحصاد البوارز العقدية ، تفكك النسيج المقطوع في مجلس الأمن القومي المتوسطة للحصول على تعليق خلية واحدة ، وأخيرا طلاء الخلايا في ثقافة وكالة الامن القومي. بعد 5-7 أيام في الثقافة ، هي في passaged neurospheres الناتجة الأولية لتوسيع عدد NSCs للتجارب المستقبلية.
Protocol
1. تعيين الأساسية حتى قبل الشروع في تشريح : مستعدة المتوسطة الحجم المناسب لمجلس الأمن القومي الشامل ، عن طريق المزج NeuroCult NSC بصل متوسطة والمكملات NeuroCult انتشار NSC بنسبة 9:1 ، على التوالي. وارتفعت …
Discussion
في مقايسة neurosphere هو الأسلوب المفضل لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية 1-5 بسبب بساطته والتكاثر. هذا الاختبار هو أداة لا تقدر بثمن على نطاق واسع جيل من خلايا غير متمايزة CNS السلائف ، والتي يمكن استخدامها على حد سواء في التجارب المختبرية والدراسات المجراة.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة Overstreet.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
NeuroCult NSC Basal Medium
Medium
Stem Cell Technologies
05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements
Medium supplement
Stem Cell Technologies
05701
%0.05 trypsin-EDTA
Reagent
Gibco
25300-062
Soybean trypsin inhibitor
Reagent
Sigma
T6522
Pen/Strep
Reagent
Gibco
15140-122
*MEM
Reagent
Gibco
41500-018
HEM component
*HEPES
Reagent
Sigma
H4034
HEM component
*Distilled water
Reagent
Gibco
15230-147
Cell strainer
Sieve
BD Falcon
352340
T25 flask
Culture ware
Nalge Nunc international
136196
T80 flask
Culture ware
Nalge Nunc international
178905
15 ml tubes
Culture ware
BD Falcon
352096
50 ml tubes
Culture ware
BD Falcon
352070
Fine curved forceps
Surgical tools
Fine Science Tools
11251‐35
Small fine forceps
Surgical tools
Fine Science Tools
11272‐30
Small forceps
Surgical tools
Fine Science Tools
11050‐10
Fine scissors
Surgical tools
World Percision Instruments, Inc.
500216
EGF
Growth factor
R&D
2028-EG
b-FGF
Growth factor
R&D
3139-FB
Heparin
Growth factor
Sigma
H4784
Reconstituted in PBS
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457, doi:10.3791/2457 (2011).