Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay
Summary
Deze video toont protocol de toepassing van de neurosphere test voor de isolatie en de uitbreiding van neurale stamcellen van het ganglionisch eminenties van embryonale dag 14-hersenen van muizen.
Abstract
In zoogdieren, stamcellen fungeert als een bron van ongedifferentieerde cellen naar cel ontstaan en vernieuwing in verschillende weefsels en organen te behouden gedurende de levensduur van het dier. Ze kunnen eventueel vervangen door cellen die verloren zijn gegaan in het verouderingsproces en bij het proces van letsel en ziekte. Het bestaan van neurale stamcellen (NSCs) werd voor het eerst beschreven door Reynolds en Weiss (1992) in de volwassen centrale zenuwstelsel (CZS) met behulp van een nieuw serum-vrije cultuur systeem, de neurosphere assay (NSA). Met behulp van deze test, is het ook mogelijk te isoleren en uit te breiden NSCs uit verschillende regio's van de embryonale CZS. Deze in vitro uitgebreid NSCs zijn multipotente en kunnen aanleiding geven tot de drie belangrijkste celtypes van het centrale zenuwstelsel. Terwijl de NSA lijkt relatief eenvoudig uit te voeren, de aandacht voor de procedures aangetoond hier is nodig om betrouwbare en consistente resultaten te bereiken. Deze video toont op een praktische NSA te genereren en te NSCs uit te breiden van embryonale dag 14-mouse hersenweefsel en zorgt voor technische details, zodat men kan bereiken reproduceerbaar neurosphere culturen. De procedure omvat het oogsten E14 muizenembryo's, de hersenen microdissectie het ganglion eminenties, dissociatie van het geoogste weefsel in NSC medium oogst naar een enkele celsuspensie te krijgen, en uiteindelijk plating cellen in NSA cultuur. Na 5-7 dagen in cultuur, zijn de resulterende primaire neurospheres gepasseerd verder uit te breiden het nummer van de NSCs voor toekomstige experimenten.
Protocol
Discussion
De neurosphere assay is de methode van keuze voor de isolatie en de uitbreiding van neurale stamcellen 1-5 vanwege de eenvoud en reproduceerbaarheid. Deze test is een waardevol instrument voor grootschalige opwekking van ongedifferentieerde CNS voorloper cellen, die kunnen worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo studies. Benadrukt moet worden dat neurospheres kunnen worden gegenereerd uit zowel de bonafide neurale stamcellen en meer beperkt voorlopers. Daarom is de berekening van de neurosphe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Overstreet Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Percision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. e. y. n. o. l. d. s. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
