نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول بسيطة لإنشاء مكتبة عشوائية متحولة عن تسلسل هدف ما. نظهر كيف يمكن أن يقترن هذا الأسلوب ، والتي تتم في الجسم الحي في كولاي ، مع تحديدات وظيفية لتطوير الأنشطة الأنزيمية جديدة.
الجيل كفاءة التنوع الجيني تمثل أداة لا تقدر بثمن الجزيئية التي يمكن استخدامها لتسمية توليف الحمض النووي ، لإنشاء توقيعات الجزيئي فريدة من نوعها ، أو أن تتطور البروتينات في المختبر. هنا ، فإننا نقدم البروتوكول الذي يسمح للجيل من المكتبات (10> 11) كبير متحولة عن هدف تسلسل معين. ويستند هذا الأسلوب على تكرار ترميز ColE1 البلازميد التسلسل المطلوب من قبل متغير منخفضة الدقة من بوليميريز الحمض النووي الأول (LF – بول الأول). تحول الهدف البلازميد الى سلالة من mutator E. القولونية ومطلي على وسائل الاعلام الصلبة ، والغلة بين 0.2 و 1 الطفرات / كيلوبايت ، اعتمادا على موقع الجين المستهدف. تحقيق سرعات أعلى للطفرة التي بالتكرار هذه العملية من الطفرات. بالمقارنة مع طرق بديلة من الطفرات ، لدينا بروتوكول تبرز لبساطتها ، والأمر لا ينطوي على الاستنساخ أو PCR. وهكذا ، لدينا وسيلة مثالية لوضع العلامات طفرية البلازميدات أو غيرها من القوالب أنا بول أو لاستكشاف قطاعات واسعة من الفضاء تسلسل لتطور الأنشطة غير موجودة في الهدف الأصلي. لرقابة مشددة المكانية التي يمكن أيضا PCR أو عشوائية أساليب العرض قليل النوكليوتيد المستندة يمكن تحقيقه من خلال الاستنساخ اللاحقة من أجزاء معينة من المكتبة. هنا نقدم البروتوكولات توضح كيفية إنشاء مكتبة عشوائية متحولة وكيفية وضع المخدرات على أساس التحديدات في E. القولونية لتحديد الأنشطة البيوكيميائية المسوخ العارضة الجديدة.
هذا المقال يقدم بروتوكول الطفرات التي تسمح للجيل من المكتبات الكبيرة متحولة عشوائي دون الحاجة لاستنساخ أو PCR. ويستند هذا الأسلوب على تكرار الخطأ ، المعرضة للترميز البلازميد سلسلة من الفائدة. أنتجت حجم زعيم حبلا وسيطة من الناحية النظرية ، ينبغي أن الطفرات تقتصر إلى حد كبير إلى غليان 100-300 يقع المصب على الفور من الحمض النووي الريبي التبديل / الحمض النووي ، التي أنا بول 2،10. وجدنا أن وفقا للشروط الواردة في هذا البروتوكول ، وأنا بول الطفرات تحدث في جميع أنحاء البلازميد ، على الرغم من تراجع في وتيرة والمسافة من الزيادات أوري البلازميد (الشكل 3). هذه النتيجة تعني أن الانتقال أو "تبديل" من أنا لبول بول الثالث خلال تكرار ColE1 البلازميد هو أكثر بكثير مما ذكر سابقا تدريجيا ، على الأقل في ظل ظروفنا التجريبية 2 ، وتتفق مع دراسات سابقة يشير الى التكرار الوظيفي بين بول وبول لي ثالثا 11.
وصف بروتوكول لدينا الأصلي الطفرات في الثقافات السائل (4). هذا البروتوكول غلة 0.41 الطفرات / كيلو ل<أي د ، 1000 في غليان 1000 المتاخمة للRNA / DNA التبديل (الجدول 1). Hypersaturation من خلال ترك السائل في الثقافة شاكر لمدة 3 أيام دون إضافة أية وسيلة إعلامية جديدة ترفع من وتيرة التحول إلى 0.70 الطفرات / كيلوبايت ولكن النتائج في الغلة البلازميد الفقيرة جدا (أقل من 1 ٪ مقارنة مع اليوم 1 ، والبيانات لا تظهر) ( الجدول 1). هنا نقدم مبسطة مبنية على بروتوكول الطلاء مباشرة على التحول من هدف البلازميد على أجار الصلبة في 37 درجة مئوية (الشكل 1). هذا الإجراء ينتج أكبر تردد وجود طفرة / دورة من الطفرات (0.92 الطفرات / كيلو لد <1000) ، ويسهل كثيرا التكرار. الظروف المتغيرة للثقافة وسائل الاعلام الصلبة يؤثر أيضا على الطيف الطفرة (الجدول 2). الطفرات الطلاء مباشرة يقلل من التباين بين ملحوظ التكميلية استبدال قاعدة الزوج ينظر في الثقافة السائل (قارن C → T → G مقابل ألف وألف → → T G مقابل C). من ناحية أخرى ، أنتجت أكثر من الطلاء مباشرة indels (من 0.5 ٪ إلى أقل من 4 ٪) وانخفض عدد والطفرات التي → G – 3 أضعاف ، مما أدى إلى زيادة تمثيل G / C الطفرات (74 ٪). عموما ، فإننا نعتقد أن أكبر البساطة وزيادة الكفاءة للبروتوكول الطلاء مباشرة المعروضة هنا تفوق الفوائد من الطيف تحور قليلا أكثر توازنا التي تنتجها الطفرات السائل.
ضمن هدف البلازميد ، لا تقتصر على الطفرات الناتجة عن اسلوبنا في تسلسل الهدف المنشود. ومع ذلك ، ينبغي أن تطور الأنشطة البيوكيميائية الرواية تعتمد على الطفرات في الجينات المستهدفة ، لأنها تمثل النوعية بدلا من مجرد تغيير كمي. وهكذا ، والجمع بين الطفرات دينا البلازميد مع الفرز من المسوخ على لوحات التدرج تستفيد من نقاط القوة في نظامنا (مكتبات كبيرة وتوافر الاختيار) للتطور الخصائص الكيميائية الحيوية الجديدة. تطبيقات أخرى من الطفرات العشوائية مثل تحسين الأنشطة القائمة أو الأنزيمية العشوائي مجالات محددة من الجينات لا تتطلب الاستنساخ التالية الطفرات العشوائية. في هذه الحالة ، بعد أن المكتبة في البلازميد في مقابل منتج PCR التضخيم يحسن كفاءة الاستنساخ عن طريق تسهيل التضخيم والتقييد.
باختصار ، علينا أن نظهر بروتوكول بسيطة لإنشاء مكتبة عشوائية متحولة عن الجينات المستهدفة نظرا إلى أن تبرز لبساطتها والتنوع من مكتبات تم إنشاؤها. نظهر كيف يمكن أن يقترن هذا الأسلوب مع التحديدات الفنية لتطوير كفاءة الأنشطة البيوكيميائية جديدة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لدينا في الجسم الحي ولدت المكتبات تكون مستنسخة بسهولة ، مما يتيح للموقع المحدد الطفرات أو التحسين من الأنشطة القائمة.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل الجائزة CA116429 K08 – 04 لمولودية ومنحة من قهر السرطان الآن (قلق) الأساس # 8501
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
carbenicillin | CellGro | 46100R6 | 0.1mg/ml final | |
tetracycline | Fisher | BP7640 | 0.05mg/ml final | |
chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final | |
LB Agar Miller | Fisher | BP1425 | ||
LB Broth Miller | Difco | 244620 | ||
Soft Agar | Difco | 214580 | Made in house | |
Acridine Orange | Sigma | A38401-1 | ||
Antifoam B emulsion | Sigma | A5757 | ||
Glycerol | Acros | 332030025 | ||
100x100x15mm sq dish | Fisher | 0875711A | ||
100mm rnd dish | Fisher | 0875712A | ||
Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | ||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
2mm gap tubes | MolBioproducts | 5520 | ||
Zippy mini prep kit | Zymo | D4020 |