I. Geração de uma Biblioteca Aleatório Mutant Pol I iniciação media de ColE1 replicação do plasmídeo (revisto em (1-3). Nosso método de mutagênese se baseia em colocar uma seqüência alvo de um plasmídeo adjacentes ColE1 a origem ou a replicação e propagação em células que expressam baixa fidelidade DNA polimerase I (LF-Pol I). LF-Pol I é uma DNA polimerase mutante eu codificação de três mutações que diminuem a fidelidade da replicação, ou seja, I709N (em motif A), A759R (em motivo B) e D424A (inativação de revisão) 4,5 . LF-Pol I é expressa em uma cepa de E. coli, JS200, que tem um alelo sensíveis à temperatura da Pol I (polA12) (6), para que LF-Pol I torna-se a atividade predominante a 37 ° C. A replicação do seqüência alvo em polA12 células sob condições restritivas resultados na geração de uma biblioteca aleatória mutante. Mutagênese é mais eficiente em culturas saturadas 4. Por razões que ainda não estão claros, mutagênese não é contínua, ou seja, a freqüência de mutação não aumenta linearmente com o número das gerações uma vez que a cultura atinge a saturação, mesmo se as células estão autorizados a expandir ainda mais na mídia fresco. Portanto, aumentando ainda mais a carga de mutação da biblioteca exige iterativo rodadas de mutagênese e recuperação plasmídeo. Aqui nós fornecemos protocolos para LF-Pol mutagênese I. Note-se que os protocolos aqui apresentados foram bastante simplificadas em relação a nossos 4 descrição original, a fim de facilitar a iteração do processo para atingir a carga mutação desejada (Fig. 1). Materiais Células: JS200 recA718 polA12 (ts) uvrA155 trpE65 lon-11 sula JS200 WT-Pol I: JS200 células que expressam tipo selvagem (WT) Pol I JS200 LF-Pol I: JS200 expressando fidelidade baixa (LF) Pol I Tensão de leitura: JS200 WT-Pol I ou (para complementação) uma cepa falta de uma atividade específica Alvo Plasmid Plasmídeo contendo uma origem de replicação ColE1 com o gene alvo clonado em 1. Antes de Mutagênese: Preparação de electro-JS200 células competentes LF-Pol I Escolher um único JS200 LF-Pol colônia I de uma placa de LB crescido a 30 ° C (condições permissivas) durante a noite contendo a seleção apropriada de antibióticos para o rolamento plasmídeo LF-Pol I (0,03 mg / mL cloranfenicol) e coloque a colônia em um teste tubo contendo 8 mL de LB com cloranfenicol. Crescer a cultura a 30 ° C e agitação a 250rpm durante a noite. Na parte da manhã, expandir a cultura, derramando o mL 8 de JS200 LF-Pol I em um frasco contendo 400 mL LB com cloranfenicol. Deixe crescer a cultura a 30 ° C agitando a 250rpm até atingir um 600 A de ,4-0,7 (normalmente 3-4h). Uma vez em um 600 A de 0,4-0,7, chill a cultura no gelo molhado por 15 minutos. Transferir a cultura refrigerados para um recipiente adequado para a centrifugação. Pellet células por centrifugação a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante, e depois adicionar 10 mL de glicerol estéril e refrigerados (em gelo molhado) 10% para o recipiente e volte a suspender as células com uma pipeta sorológica. Transferência das células re-suspensas em tubo cônico de 50 mL. Encha o tubo cônico até a marca de 45 mL de glicerol 10% e, em seguida, centrifugar por 15 minutos a 4 ° C e 4000rpm. Deitar fora o sobrenadante, adicionar 10 mL uma vez mais, de glicerol 10% para o tubo cônico, e re-suspender as células com uma pipeta sorológica ou normal. Mais uma vez, encher o tubo cônico de 45 mL da marca com 10% de glicerol e centrifugar por 15 minutos a 4 ° C e 4000rpm. Repita esse processo mais duas vezes para remover todos os vestígios de sais. Após a rodada final, re-suspender o pellet de células em partes iguais o glicerol 10% (ie re-suspensão 2 mL de células com 2 mL de glicerol 10%). Alíquota entre 100 mL e 500 mL da suspensão de células em tubos de armazenamento diversos. Quick-congelar as células em gelo seco e, em seguida, armazená-los a -80 ° C. Antes de usar as células para eletro-competentes transformações, descongelar as células lentamente em gelo. 2. Mutagênese: Transformando o alvo plasmídeo Pipetar 40 mL do electro-JS200 células competentes LF-Pol I e entre 30-250ng do DNA alvo plasmídeo em uma cubeta de eletroporação gap 2mm. Nota # 1: A ColE1 plasmídeo contendo GFP pode ser realizada através de mutagênese em paralelo com o gene alvo, um controle. Após a conclusão da etapa de leitura, GFP pode ser semeadas em placas de ágar LB e visualizados por mutagênese. Colônias que estão escuras ou dim conter mutações inativadoras. Pulso a mistura no electroporator a 1800V. Verificar a constante de tempo (T C) para garantir condições de eletroporação uniforme para cada amostra; idealmente T C = 5-6 seg. Recuperar a mistura de células / DNA em 1 mL de caldo LB por 40 minutos a 37 ° C (rescondições trictive), agitando a 250 rpm. ML placa 50 da cultura de recuperação em um prato de agar LB 100 milímetros Petri pré-aquecido a 37 ° C contendo tanto cloranfenicol e uma concentração adequada de um antibiótico para selecionar o alvo plasmídeo. Nota: # 2: Procure a placa de células em um "perto do gramado" concentração. A "perto do gramado" concentração é definido como um número distinto, mas incontável de colônias (> 1000 colônias / prato 100mm). A diluição banhado, se houver, vai depender de como eletro-competentes as células são. Se as células não são muito electro-competente e um "gramado próximo" não é alcançável por plaqueamento da cultura de recuperação "puro", em seguida, centrifugar a cultura de recuperação de 2 minutos a 4000rpm, despeje o sobrenadante, ressuspender as células em 50 mL de caldo LB e placa de cultura. Incubar a dishe Petri (s) durante a noite a 37 ° C. 3. Mutagênese: recuperação Plasmid No dia seguinte, lave os pratos de Petri por pipetagem 2 mL de caldo LB sobre as células. Transferir as colônias de bactérias a partir do agar LB pratos de Petri para o caldo LB por "lavagem"-los fora da placa com uma vareta de vidro esterilizado em forma de triângulo. Adicionar 1 mL de caldo LB primeiro, recolher a lavagem e repetir o procedimento com a segunda mL de caldo LB. Isolar o DNA do plasmídeo da lavagem de placas. (Este DNA plasmídeo constitui a biblioteca). Nota # 3: A lavagem coletados a partir da placa LB pode ser muito denso para mini-prep na sua totalidade. Se este for o caso, mini-prep máximo o valor atribuído pelo seu kit mini-prep (tipicamente, isto envolveu diluindo sua lavagem para OD = 1 e preparando ~ 3 mL da cultura diluída) ou escala de até um maxi-prep 4. Iteração Restringir 1μg do DNA isolado do plasmídeo com uma enzima de restrição que lineariza o LF-Pol I plasmídeo, mas não cortar seu alvo plasmídeo (Recurso Fig. 1). Limpar a digerir restrição usando um kit de purificação de DNA. Note # 4: Esta etapa remove todos os traços da enzima de restrição e seu buffer. Este passo é essencial para manter a baixa concentração de sal para posterior eletro-competentes transformações. Re-transform 30-250ng do restrito volta biblioteca-alvo plasmídeo em fresco JS200 LF-Pol eu células para colocar a biblioteca através de rondas subsequentes de mutagênese. Nota 5: linearização da Pol I plasmídeo usando uma enzima de restrição garante que somente o alvo plasmídeo se transforma. Repita as seções 2 e 3. 5. Leitura Restringir o DNA isolado do plasmídeo com uma enzima de restrição (s) que lineariza alvo tanto do plasmídeo e da Pol I plasmídeo. Executar o digest em um gel de agarose 1% para garantir a quantidade ea qualidade dos plasmídeos. Restringindo ~ 400ng do DNA isolado do plasmídeo é geralmente suficiente para análise. Restringir 1μg do DNA isolado do plasmídeo com uma enzima de restrição que lineariza o LF-Pol I plasmídeo, mas não cortar seu alvo plasmídeo. Limpar a digerir restrição usando um kit de purificação de DNA. Transformar a biblioteca de destino restrito plasmídeo em uma cepa de leitura para caracterizar as mutações. II. Tela mutante e Análise de Traço Usando placas de crescimento Gradiente. A fim de ilustrar como a grande diversidade genética presente em nossas bibliotecas podem ser acoplados a uma seleção funcional, aqui nós fornecer um protocolo de drogas baseado em seleções funcional in vivo em E. coli. Este método baseia-se crescimento ao longo de um gradiente de droga em ágar sólido. Isto permite a caracterização simultânea de múltiplas amostras (até 12) em uma faixa de concentrações, proporcionando uma maior gama dinâmica do que um tratamento medicamentoso único. Outra vantagem é que a leitura não-linear deste ensaio buffers diferenças moderadas da viabilidade, dentro de uma faixa de 2 vezes. Assim, este ensaio de citotoxicidade resistência fornece um meio robusto e rápido para selecionar mutantes e bibliotecas para determinar o perfil fenotípico de mutantes individual. Fig. 2 mostra um exemplo de cada um desses usos: Um painel de seleção de mutantes mostra individual de um oxidativo demetilase humana ABH2 biblioteca. Colônias que crescem acima do limiar WT são selecionados para maior proteção contra a citotoxicidade causada pela metilação de metano sulfonato de agente de metila (MMS) 7. Painel B mostra um exemplo de gradientes utilizados para a caracterização clone individual. O nível de resistência à terceira geração de cefalosporinas com antibióticos cefotaxima é mostrado em um gradiente de agar para WT β-lactamase e por duas espectro estendido-mutantes, R164H e R164S E104K G267R 4. Note que, dependendo da força dos efeitos observados, mais do que uma única placa pode ser necessário para a quantificação adequada: enquanto o gradiente 0.4mg/ml permite a comparação direta com o controle de clones, o nível de resistência do mutante mais poderosa só pode ser estabelecida usando uma maior concentraçãoconcentração de cefotaxima (4mg/ml). Materiais Equipamento 100x100x15mm quadrados placas de Petri (Fisher Sci # 0875711A) 100 milímetros de Petri rodada 25x75x1mm lâmina de vidro (Fischer Sci # 1255015) 50 tubo de ml Mídia Agar LB: derretido e equilibrada em banho-maria a 56 ° C Nota 6: temperatura da mídia pode afetar a estabilidade e, portanto, a atividade da droga ou composto sendo examinados. Agar Soft: derretido e equilibrada em banho-maria a 42 ° C 1. Construção do gradiente Marca de dez faixas, espaçados uniformemente ao longo de uma borda da parte inferior da placa de Petri quadrados. Coloque o prato sobre uma inclinação tal que a borda inferior é elevado marcado sete milímetros; uma grama grossa ou outro objeto plano pode ser usado como apoio para elevar o prato. Despeje 25 ml de água morna (~ 56 ° C) agar LB bem misturada com uma concentração adequada do agente selecionando no prato inclinado. Esta é a camada inferior do gradiente. Verifique se o agar LB uniformemente casacos placa de Petri de tal forma que ao final, marcada elevados do prato contém ~ 1mm de agar LB ea parte baixa contém ~ 8mm de agar LB. Em seguida, permitir agar para definir por 10-15 minutos. Nota 7: Para selecionar agentes hidrofóbicos, surfactante 0,1% (antiespumante B emulsão) podem ser adicionados ao ágar LB para facilitar a suspensão e distribuição uniforme da droga. Adicionar surfactante para o agar LB morna estéril com agitação vigorosa antes da adição do agente de seleção. O surfactante deve suspender como uma névoa fina de pequenas gotículas, gotículas grandes indicam os meios de comunicação é muito quente e pode inibir a distribuição uniforme da droga teste. Após a primeira de 25 mL de agar LB tem endurecido, o prato é movido para uma superfície plana. Em seguida, 25 mL de agar LB sem o agente seleção é derramado para cobrir a superfície de ágar primeiro LB. Esta é a camada superior do gradiente. Verifique se o agar LB cobre toda a superfície da camada inferior. Cubra com askew tampa para ventilação e permitir agar para definir por 10-15 minutos. Nota 8: Esteja ciente dos riscos potenciais de aerossóis e volatilização do composto de ensaio, deitar gradientes em uma capa de segurança química ou biológica se prescrito pelos requisitos de segurança química. Note # 9: pratos Gradiente deve ser utilizado dentro 4h para preservar o gradiente de concentração do medicamento ou substância de prova. 2. Selo de transferência de bactérias Ágar mole deve ser equilibrado a 42 ° C. Transferir 2 mL de ágar mole líquido na tampa ou fundo de um prato de Petri 100 milímetros rodada. Pipetar 40 mL da cultura bacteriana no agar macio e então misture balançando a placa. Note # 10: O estágio de crescimento de uma cultura bacteriana pode afetar sua resposta a uma droga ou substância de prova. Culturas em fase log ou culturas durante a noite em fase estacionária deve ser usado com consistência para resultados uniformes. Densidade celular também pode distorcer os resultados relativos, assim, todas as culturas devem ser diluídas de ter combinado A 600 valores de densidade. Culturas devem ser diluídas durante a noite para ter um A 600 de densidade inferior a 1,0 Brasão beira da longa da lâmina de vidro com a mistura de agar macio. Então, alinhando a borda revestida do slide com a marca inferior (de baixo para alta concentração) no prato gradiente, toque no slide para a superfície do ágar. Um toque suave é suficiente para transferir uma fita do ágar mole à superfície gradiente. A lâmina é reservada para limpeza e reutilização. Repita esse processo, para o restante das amostras bacterianas. Amostras de referência devem ser incluídos em cada prato, se gradiente gradientes múltiplos estão sendo executados. Incubar a top prato gradiente baixo durante a noite a 37 ° C. Tempos e temperaturas de incubação pode variar de leitura diferentes cepas de bactérias, mas durante a noite a 37 ° C é geralmente suficiente para o crescimento visível. 3. Analisando imagens e Crescimento Imagem: Depois de um crescimento durante a noite, gradientes podem ser observados directamente ou fixadas e coradas com uma solução de 0,2 mg / mL de acridina laranja em EtOH 95%, para melhorar o contraste. A placa é incubada a temperatura ambiente por 5 min, na solução de coloração, em seguida, lavado com EtOH 95% e, em seguida, com imagens sobre uma caixa de luz UV. Note # 11: Tome cuidado para não lavar as colônias da placa de rocha, mas sim a solução de coloração e lava sobre a placa e remova as soluções dos cantos. Para a análise de fenótipo de cada um dos plasmídeos mutante, a distância de crescimento contra o gradiente de concentração é normalizado para um padrão em cada gradiente. Estes valores relativos podem então ser comparados entre gradientes. Note # 12: Dependendo da natureza do efeito citotóxico, uma borda afiada ou uma borda mais difusa pode ser observada (compare por exemplo Painéis A e B na Figura 2). No caso de bordas difusas, é aconselhável para medir o limitef crescimento contínuo, como colônias individuais tendem a mostrar maior variabilidade. Para a seleção de biblioteca, colônias individuais que crescem em concentrações mais elevadas do que o controle tipo parental selvagem estão isolados e seqüenciados para identificar as mutações que contribuem para maior proteção. III. Resultados representativos: Figura 1. Comparação entre protocolos de mutagênese líquido e direta em placas. O protocolo de mutagênese direta plating apresentado aqui (em baixo) é mais rápido e exige menos etapas do que o nosso protocolo de mutagênese originais líquido (superior). Quando GFP é utilizada como um repórter, as variações de fluorescência são indicativos da diversidade genética presente na biblioteca. Tipicamente, um ciclo de resultados mutagênese em colônias 12-18% com níveis significativamente diminuídos de fluorescência. Figura 2. Resistência ensaios gradiente. Um painel de seleção para aumento da resistência ao Metil-metanossulfonato (MMS). Bibliotecas Plasmid do ser humano oxidativo demetilase ABH2 foram selecionados para aumento da resistência ao MMS. Duas bibliotecas que representem dois e quatro iterações do protocolo de mutagênese são mostrados em relação ao tipo parental selvagem (WT) eo vetor vazio (Δ). A linha branca representa o limiar acima do qual individuais colônias mutantes foram isolados para análise fenotípica mais. Painel B proteção Cefotaxima, indicativo de espectro estendido atividade β-lactamase. R164H e E104K R164H G267R, dois mutantes de beta-lactamase previamente identificados seguintes LF- Pol mutagênese eu acoplado ao aztreonam seleção 4, são mostrados em uma 0.4μg/mL e um gradiente cefotaxima 4μg/mL. Note que o tipo selvagem da enzima β-lactamase não confere proteção em relação a células que expressam um vetor vazio, Δ. Portanto, esses mutantes representam a evolução de uma nova atividade bioquímica 8,9. Figura 3. Freqüência de mutação em função da distância da ori (d). A frequência de mutação após um único ciclo de mutagênese plaqueamento direto é mostrado para intervalos de 100 pb em relação ao interruptor de RNA / DNA da origem ColE1 de replicação. A área entre 1600 e 2400 não é representado por β-lactamase não representa um alvo neutro. Os pontos além β-lactamase intervalos representam 200 bp, dada a baixa freqüência de mutação nesta área. A tendência (equação binomial, com um R 2 = 0,41) é mostrado como uma linha. Figura suplementares 1. Pol LF Pol I-I contendo plasmídeo. A seqüência (formato FASTA). Informações de seqüência para a determinação da enzima de restrição adequada (s) para usar quando linearização da Pol I plasmídeo ou para a iteração (geração de um passo aleatório mutação biblioteca 4) ou de leitura (passo 5). B características gerais e mapa de restrição do plasmídeo. A localização da origem de replicação pSC101, o marcador de resistência cloranfenicol (CAT) e LF-Pol gene que são apresentados. A localização de sítios de restrição único é indicado também. Biblioteca Plating direta Líquido (1 dia) Líquido (3 dias) Mutações (#) 95 40 142 Clones seqüenciados 288 96 190 Cobertura total (bp) 182000 102000 213000 Mutação freq (x10 3 bp) 0,52 0,39 0,67 Freq d <1000 (x10 3 bp) 0,92 0,41 0,70 Tabela 1. Freqüências de mutação Frequências (expresso em n º de mutações / bp) para d <1000, ou seja, dentro da bp 1000 ao lado do interruptor de RNA / DNA, por três protocolos mutagênese:. Plaqueamento direto, saturação de líquido (1 dia), e hypersaturation líquido ( 3 dias). Plating direta Líquido Mutações (#) 95 182 Espectro (%) A a G A a G 6,3 19,2 T para C 4,2 3,8 C para T G a A 27,4 13,7 C para T 35,8 35,2 A a T A a T 5,3 8,2 T a A 5,3 7,1 T para G T para G 1,1 1,1 A para C 0,0 2,2 G para T G para T 1,1 2,7 C para A 2,1 2,7 C para G C para G 2,1 1,1 G para C 5,3 2,7 Indels Ins 3,2 0,0 Del 1,1 0,0 A a N 11,6 29,7 G a N 33,7 19,2 T para N 10,5 12,1 C para N 40,0 39,0 Ts 73,7 72,0 TV 22,1 28,0 Indels 4,2 0 Tabela 2. Métricas de mutação para plaqueamento direto e mutagênese líquido. O quadro apresenta o número de mutações observadas (em número) eo espectro de mutação (em%) após um único ciclo de mutagênese. O espectro é dividido em pares complementares, por mudanças de nucleotídeos, e pelo tipo de mutação.