Summary
Hier laten we zien een eenvoudig protocol om een willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde doelsequentie. We laten zien hoe deze methode, die in vivo uitgevoerd in Escherichia coli, kan worden gecombineerd met functionele selecties van nieuwe enzymatische activiteiten evolueren.
Abstract
De efficiënte generatie van de genetische diversiteit is een waardevol moleculair instrument dat kan worden gebruikt om de DNA-synthese label, unieke moleculaire handtekeningen te creëren, of om eiwitten ontwikkelen in het laboratorium. Hier presenteren we een protocol dat de generatie van grote (> 10 11) mutant bibliotheken voor een gegeven doelsequentie mogelijk maakt. Deze methode is gebaseerd op de replicatie van een ColE1 plasmide dat codeert voor de gewenste volgorde door een low-fidelity variant van DNA-polymerase I (LF-Pol I). De beoogde plasmide wordt getransformeerd in een mutator stam van E. coli en uitgeplaat op vaste media, waardoor tussen de 0,2 en 1 mutaties / kb, afhankelijk van de locatie van het target-gen. Hogere mutatie frequenties worden bereikt door het itereren dit proces van mutagenese. In vergelijking met alternatieve methoden van mutagenese, ons protocol valt op door zijn eenvoud, omdat er geen klonen of PCR betrokken zijn. Dus, onze methode is ideaal voor het mutatie-etikettering van plasmiden of andere Pol ik sjablonen of voor grote delen van sequentie ruimte te verkennen voor de evolutie van de activiteiten niet in de oorspronkelijke doelstelling. De strakke ruimtelijke controle dat de PCR of gerandomiseerde oligonucleotide-gebaseerde methoden bieden ook kan worden bereikt door de volgende klonen van specifieke delen van de bibliotheek. Hier geven we protocollen laat zien hoe een willekeurige mutant bibliotheek te creëren en hoe je drugs op basis van selecties in E. vestigen coli mutanten vertonen nieuwe biochemische activiteiten te identificeren.
Protocol
I. Het genereren van een Random Mutant Bibliotheek
Pol Ik bemiddelt begin van de ColE1 plasmide replicatie (beoordeeld in (1-3). Onze methode van mutagenese is gebaseerd op het plaatsen van een doelsequentie in een ColE1 plasmide naast de herkomst of replicatie en uitdragen van het in cellen die low-fidelity DNA polymerase I (LF-Pol I). LF-Pol I is een mutant DNA-polymerase I dat codeert voor drie mutaties die de trouw van replicatie, namelijk I709N (in motief A), A759R (in motief B) en D424A (inactiveren proeflezen) 4,5 afname . LF-Pol I wordt uitgedrukt in een E. coli-stam, JS200, dat een temperatuur-gevoelige allel van Pol I (polA12) (6) is zo dat de LF-Pol I wordt de belangrijkste activiteit bij 37 ° C. Replicatie van de doelsequentie in polA12 cellen onder beperkende voorwaarden resulteert in het genereren van een willekeurige mutant bibliotheek. Mutagenese is efficiënter in verzadigde culturen 4. Om redenen die nog steeds onduidelijk, mutagenese niet continu is, dat wil zeggen de mutatie frequentie niet lineair toeneemt met het aantal van generaties eens de cultuur in verzadiging, zelfs als cellen mogen verder uit te breiden in verse media. Daarom, een verdere verhoging van de mutatie belasting van de bibliotheek vereist iteratieve rondes van mutagenese en plasmide herstel. Hier hebben we protocollen voor LF-Pol I mutagenese te bieden. Merk op dat de protocollen die hier aanzienlijk zijn geweest ten opzichte van onze oorspronkelijke beschrijving 4 vereenvoudigd om herhaling van het proces te faciliteren voor het bereiken van de gewenste mutatie belasting (afb. 1).
Materialen
- Cellen: JS200 recA718 polA12 (ts) uvrA155 trpE65 lon-11 sula
- JS200 WT-Pol I: JS200 cellen die wild-type (WT) Pol I
- JS200 LF-Pol I: JS200 uiten low fidelity (LF) Pol I
- Uitlezen stam: JS200 WT-Pol I of (voor complementatie), een stam ontbreekt een specifieke activiteit
- Target Plasmide
- Plasmide dat een ColE1 oorsprong van replicatie met de doelgroep-gen gekloond in
1. Voordat Mutagenese: Voorbereiding van electro-competente JS200 LF-Pol I cellen
- Kies een JS200 LF-Pol I kolonie van een LB plaat gegroeid bij 30 ° C (tolerante voorwaarden) 's nachts met de juiste antibiotica selectie voor het plasmide met LF-Pol I (0,03 mg / ml chlooramfenicol) en plaats de kolonie in een test buisje met 8 ml LB met chlooramfenicol. Groeien de cultuur bij 30 ° C en schudden bij 250rpm 's nachts.
- In de ochtend, de cultuur uit te breiden door het gieten van de 8 ml van de JS200 LF-Pol ik in een kolf met 400 ml LB met chlooramfenicol. Laat de cultuur groeien bij 30 ° C, terwijl schudden bij 250rpm tot hij een A-600 van ,4-0,7 (typisch 3-4h).
- Eenmaal op een A-600 van 0,4-0,7, chill de cultuur op nat ijs gedurende 15 minuten.
- Breng de gekoelde cultuur naar een geschikte container om centrifugeren. Pellet-cellen door centrifugeren bij 4 ° C. Giet het supernatant en voeg 10 ml van de steriele en gekoeld (op nat ijs) 10% glycerol aan de container en resuspendeer de cellen met behulp van een serologische pipet.
- Breng de re-cellen gesuspendeerd in een 50 ml conische buis. Vul de conische buis tot aan de 45 ml markering met 10% glycerol en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C en 4000rpm.
- Giet het supernatant, voeg nog eens 10 ml 10% glycerol de conische buis, en resuspendeer de cellen met behulp van een serologische of normaal pipet. Nogmaals, vul de conische buis om de 45 ml markering met 10% glycerol en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C en 4000rpm. Herhaal dit proces nog twee keer om alle sporen van zouten te verwijderen.
- Na de laatste draai, resuspendeer de pellet van de cellen in gelijke deel van 10% glycerol (dwz 2 ml van de cellen opnieuw te schorsen met 2 ml 10% glycerol).
- Aliquot tussen 100 en 500 pi pi van de geschorste cellen in verschillende storage buizen. Quick-bevriezing van de cellen op droog ijs en ze vervolgens op te slaan bij -80 ° C.
- Voordat u de cellen voor elektro-bevoegde transformaties, dooi de cellen langzaam op ijs.
2. Mutagenese: Het transformeren van de doelgroep plasmide
- Pipetteer 40 ul van de electro-bevoegde JS200 LF-Pol I cellen en tussen de 30-250ng van de doel-plasmide DNA in een 2mm gat elektroporatie kuvet.
Noot # 1: Een ColE1 plasmide dat GFP kan worden uitgevoerd door mutagenese in parallel met de target-gen als een controle. Na voltooiing van de uitlezing stap, kan GFP worden uitgeplaat op LB agar platen en gevisualiseerd voor mutagenese. Kolonies die zijn te donker of schemerig bevatten inactiverende mutaties. - Pulse het mengsel in de electroporator op 1800V. Controleer de tijd constant (T C) om een uniforme elektroporatie voorwaarden te verzekeren voor elk monster; ideaal T C = 5-6 sec.
- Terug de cel / DNA mengsel in 1 ml van LB bouillon gedurende 40 minuten bij 37 ° C (restrictive voorwaarden) schudden bij 250 rpm.
- Plaat 50 pi van het herstel cultuur op een 100mm LB agar petrischaal voorverwarmd tot 37 ° C die zowel chlooramfenicol en een geschikte concentratie van een antibioticum te selecteren voor de doelgroep plasmide.
Let op: # 2: Doel tot op het bord de cellen op een "bijna grasveld" concentratie. Een "in de buurt van gazon" concentratie is gedefinieerd als een afzonderlijke, maar ontelbaar aantal kolonies (> 1000 kolonies / 100mm schotel). De verdunning vergulde, indien van toepassing, zal afhangen van hoe electro-competente de cellen. Als de cellen zijn niet erg electro-competente en een "near gazon" is niet haalbaar door uitplating het herstel cultuur "nette", dan is het herstel van de cultuur centrifuge gedurende 2 minuten bij 4000rpm, buiten giet het supernatans, resuspendeer de cellen in 50 pi van LB bouillon en het bord van de cultuur. - Incubeer de Petri dishe (s) 's nachts bij 37 ° C.
3. Mutagenese: Plasmide herstel
- De volgende dag, was de petrischalen door pipetteren 2 ml van LB bouillon over de cellen. Breng de bacteriële kolonies van de LB agar Petri schalen in de LB bouillon door "schrobben" ze uit de plaat met een gesteriliseerde driehoekige glazen staaf. Voegt u eerst een mL LB bouillon, het verzamelen van de was en herhaal de procedure met de tweede mL LB bouillon.
- Isoleer het plasmide DNA van de plaat te wassen. (Dit plasmide DNA vormt de bibliotheek).
Noot # 3: De wassen verzameld van de LB plaat misschien te dicht naar mini-prep in zijn geheel. Als dit het geval is, mini-prep de maximale toegekende bedrag door uw mini-prep-kit (meestal betrof dit verdunnen je wassen OD = 1 en prepping ~ 3 ml van de verdunde cultuur) of de schaal tot een maxi-prep
4. Herhaling
- Beperken 1μg van het geïsoleerde plasmide DNA met een restrictie-enzym dat de LF-Pol I plasmide linearizes, maar niet gesneden uw doelgroep plasmide (aanvullende Fig 1).
- Het schoonmaken van de beperking verteren met behulp van een DNA-zuivering kit.
Let op # 4: Deze stap verwijdert alle sporen van de restrictie-enzym en de buffer. Deze stap is essentieel om de zoutconcentratie laag te houden voor de latere electro-competent transformaties. - Re-transform 30-250ng van de beperkte target-plasmide bibliotheek terug in frisse JS200 LF-Pol I cellen naar de bibliotheek gebracht door middel van de volgende rondes van mutagenese.
Let op # 5: lineariseringsschakelingen de Pol ik plasmide met behulp van een restrictie-enzym zorgt ervoor dat alleen het doel plasmide wordt getransformeerd. - Herhaal de punten 2 en 3.
5. Uitlezing
- Beperk de geïsoleerde plasmide DNA met een restrictie-enzym (en) dat zowel het doel plasmide en de Pol ik plasmide linearizes. Voer de verteren op een 1% agarose gel om kwantiteit en kwaliteit van de plasmiden te verzekeren. Het beperken van ~ 400ng van de geïsoleerde plasmide DNA is meestal voldoende voor analyse.
- Beperken 1μg van het geïsoleerde plasmide DNA met een restrictie-enzym dat de LF-Pol I plasmide linearizes, maar niet gesneden uw doelgroep plasmide.
- Het schoonmaken van de beperking verteren met behulp van een DNA-zuivering kit.
- Transformeren de beperkte doelgroep plasmide bibliotheek in een uitlezing stam om de mutaties te karakteriseren.
II. Mutant Scherm en Trait analyse met behulp van Gradient groeischijven.
Om te illustreren hoe de grote genetische diversiteit aanwezig is in onze bibliotheken kan worden gekoppeld aan een functionele selectie, hier bieden wij een protocol voor drug-gebaseerde functionele selecties in vivo in E. coli. Deze methode is gebaseerd op groei langs een drug gradiënt op vaste agar. Dit maakt de gelijktijdige karakterisering van meerdere (maximaal 12) monsters over een bereik van concentraties, die een groter dynamisch bereik dan een behandeling met geneesmiddelen. Een ander voordeel is dat de niet-lineaire uitlezing van deze test een matige verschillen in de levensvatbaarheid, binnen een 2-voudige range buffers. Zo, dit cytotoxiciteit-weerstand test biedt een robuuste en snelle methode om mutant bibliotheken te selecteren en op de fenotypische profiel van de individuele mutanten te bepalen. Fig. 2 toont een voorbeeld van elk van deze toepassingen: Een panel toont selectie van individuele mutanten van een menselijke oxidatieve demethylase ABH2 bibliotheek. Kolonies groeien boven de WT drempel zijn geselecteerd voor een betere bescherming tegen cytotoxiciteit worden veroorzaakt door de stof methyl methylerende methaan sulfonaat (MMS) 7. Panel B geeft een voorbeeld van gradiënten worden gebruikt voor individuele kloon karakterisering. Het niveau van resistentie tegen de derde generatie cefalosporine antibiotica cefotaxim wordt getoond op een agar gradiënt voor WT β-lactamase en voor twee extended-spectrum mutanten, R164H en E104K R164S G267R 4. Merk op dat, afhankelijk van de sterkte van de waargenomen effecten, meer dan een enkele plaat kan nodig zijn voor een adequate kwantificering: terwijl de 0.4mg/ml gradiënt zorgt voor directe vergelijking met de controle-klonen, de mate van weerstand van de meest potente mutant kan alleen worden vastgesteld met behulp van een hogere concentratieconcentratie van cefotaxime (4mg/mL).
Materialen
- Uitrusting
- 100x100x15mm vierkante Petrischalen (Fisher Sci # 0875711A)
- 100mm ronde petrischaal
- 25x75x1mm glas microscoopglaasje (Fischer Sci # 1255015)
- 50 ml tube afgestudeerd
- Media
- LB agar: gesmolten en in evenwicht in een waterbad bij 56 ° C
Let op # 6: temperatuur van de media kunnen de stabiliteit en daarmee de activiteit van het geneesmiddel of de verbinding wordt onderzocht beïnvloeden. - Zachte Agar: gesmolten en in evenwicht in een waterbad tot 42 ° C
- LB agar: gesmolten en in evenwicht in een waterbad bij 56 ° C
1. De bouw van de gradiënt
- Mark tien rijstroken, gelijkmatig verdeeld over een rand van de bodem van het plein petrischaal.
- Plaats de schotel op een helling zodanig dat de onderste rand is gemarkeerd 7mm verhoogd;
een dikke gras of een ander plat voorwerp kan worden gebruikt als ondersteuning om de schotel te verheffen. Giet 25 ml warm (~ 56 ° C) LB-agar goed gemengd met een geschikte concentratie van het middel in het selecteren van het hellend schotel. Dit is de onderste laag van het verloop. Zorg ervoor dat de LB-agar gelijkmatig de petrischaal zodanig dat de verhoogde, gemarkeerd einde van de schotel ~ 1mm van LB agar bevat en het verlaagde deel bevat ~ 8mm van de LB-agar jassen. Laat vervolgens agar op te zetten gedurende 10-15 minuten.
Let op # 7: Voor het selecteren van hydrofobe stoffen, 0,1% oppervlakte-actieve stof (antischuim B emulsie) kunnen worden toegevoegd aan de LB agar tot schorsing en een uniforme verdeling van de drug te vergemakkelijken. Voeg oppervlakte-actieve stof aan de warme steriele LB agar met heftig schudden voorafgaand aan de toevoeging van de selectie van agent. De oppervlakteactieve stof moet opschorten als een fijne nevel van kleine druppeltjes, grote druppels geven de media is te heet en kan remmen uniforme verdeling van de test drug. - Na de eerste 25 ml van LB agar is uitgehard, is de schotel verplaatst naar een vlakke ondergrond. Vervolgens wordt 25 ml van LB agar zonder het te selecteren middel goot naar de eerste LB agar oppervlak overlay. Dit is de bovenste laag van het verloop. Zorg ervoor dat de LB-agar beslaat het gehele oppervlak van de onderste laag. Bedek met deksel scheef voor de ventilatie, en laat agar op te zetten gedurende 10-15 minuten.
Let op # 8: Wees je bewust van aërosol risico's en mogelijke vervluchtiging van de testverbinding, giet gradiënten in een chemische of biologische veiligheid kap indien voorgeschreven door chemische veiligheidseisen.
Let op # 9: Verloop gerechten moet worden gebruikt binnen 4 uur om de gradiënt van het geneesmiddel of testverbinding de concentratie te behouden.
2. Stempel overdracht van bacteriën
- Zachte agar moet worden in evenwicht gebracht tot 42 ° C. Breng 2 ml vloeistof zachte agar in het deksel of bodem van een 100mm ronde petrischaal. Pipetteer 40 ul van de bacteriecultuur in de zachte agar en meng door het schommelen van de plaat.
Let op # 10: De groeifase van een bacteriecultuur kan de reactie op een geneesmiddel of testverbinding impact. Culturen in log-fase of 's nachts culturen in stationaire fase moet worden gebruikt met de consistentie voor uniforme resultaten. Celdichtheid ook scheef ten opzichte van resultaten, waardoor alle culturen moeten verdund worden tot zijn afgestemd A 600 dichtheid waarden. 'S nachts culturen moeten verdund worden tot een A 600 dichtheid van minder dan 1,0 hebben - Smeer de lange zijde van het glas microscoopglaasje met de zachte agar mengsel. Dan, het uitlijnen van de gecoate rand van de dia met de onderste merkteken (van laag naar hoge concentratie) op de helling schotel, raakt u de dia om het oppervlak van de agar. Een zachte aanraking is voldoende om een lint van de zachte agar te dragen aan de gradiënt oppervlak. De dia wordt dan gereserveerd voor reiniging en hergebruik.
- Herhaal dit proces, voor de rest van de bacteriële monsters. Referentiemonsters moeten worden opgenomen op elke helling gerecht als er meerdere hellingen worden geleid.
- Incubeer de gradiënt schotel boven naar beneden 's nachts bij 37 ° C. Tijden en temperaturen van incubatie kan verschillen voor verschillende uitlezen bacteriestammen, maar 's nachts bij 37 ° C is voldoende voor zichtbare groei.
3. Imaging en analyseren groei
- Beeldvorming: Na een nacht groei, gradiënten kunnen direct worden afgebeeld of gefixeerd en gekleurd met een oplossing van 0,2 mg / ml acridine oranje in 95% EtOH, om het contrast te verbeteren. De plaat wordt geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, in de kleuroplossing, vervolgens gewassen met 95% EtOH en vervolgens afgebeeld op een UV-lichtbak.
Note # 11: Zorg ervoor dat u koloniën spoelen van de plaat maar de kleuroplossing en wast rots over de plaat en verwijder de oplossingen van hoeken. - Voor fenotype analyse van de individuele mutant plasmiden, is de afstand van de groei tegen de concentratie gradiënt genormaliseerd op een standaard op elke helling. Deze relatieve waarden kunnen dan worden vergeleken over de hellingen.
Let op # 12: Afhankelijk van de aard van het cytotoxische effect, een scherpe rand of een meer diffuse rand kan worden waargenomen (vergelijk bijvoorbeeld Panelen A en B in figuur 2). In het geval van diffuse randen, is het raadzaam om te meten aan de rand of continue groei, als individuele kolonies hebben de neiging om grotere variabiliteit zien. - Voor de bibliotheek selectie worden de individuele kolonies die groeien bij concentraties hoger zijn dan het ouderlijk wild-type controle geïsoleerd en de sequentie tot mutaties bij te dragen aan betere bescherming te identificeren.
III. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Vergelijking tussen de vloeistof en de directe plating mutagenese protocollen. De directe beplating mutagenese-protocol hier wordt gepresenteerd (onderaan) is sneller en vergt minder stappen dan onze oorspronkelijke vloeibare mutagenese-protocol (boven). Wanneer GFP wordt gebruikt als een verslaggever, variaties in fluorescentie zijn een indicatie van de genetische diversiteit in de bibliotheek aanwezig. Typisch, een cyclus van mutagenese resulteert in 12-18% kolonies met aanzienlijk verlaagde niveaus van fluorescentie.
Figuur 2. Hellingsweerstand assays. Paneel A selectie voor verhoogde weerstand tegen Methyl-methaansulfonaat (MMS). Plasmide bibliotheken van het menselijk oxidatieve demethylase ABH2 werden geselecteerd voor een betere weerstand tegen MMS. Twee van dergelijke bibliotheken die twee en vier iteraties van de mutagenese protocol worden getoond in vergelijking met het ouderlijke wild type (WT) en de lege vector (Δ). De witte lijn geeft de drempel waarboven de individuele mutant kolonies werden geïsoleerd voor verdere fenotypische analyse. Panel B Cefotaxime bescherming, indicatief van de extended-spectrum β-lactamase-activiteit. R164H en E104K R164H G267R, twee mutanten van beta-lactamase eerder geïdentificeerde volgende LF- Pol Ik mutagenese gekoppeld aan aztreonam selectie 4, worden weergegeven op een 0.4μg/mL en een 4μg/mL cefotaxim gradiënt. Merk op dat het wild-type β-lactamase enzym geen bescherming in verhouding tot cellen die een lege vector, Δ verleent. Daarom zijn deze mutanten vertegenwoordigen de evolutie van een nieuwe biochemische activiteit 8,9.
Figuur 3. Mutatie frequentie als functie van de afstand van ori (d). De mutatie frequentie na een enkele cyclus van de directe plating mutagenese wordt getoond voor 100 bp intervallen ten opzichte van het RNA / DNA-schakelaar van de ColE1 oorsprong van replicatie. Het gebied tussen 1600 en 2400 is niet vertegenwoordigd, omdat β-lactamase niet leidt tot een neutraal doel. De punten verder dan β-lactamase vertegenwoordigen 200 bp intervallen gezien de geringe frequentie van mutatie in dit gebied. De trend (binomiale vergelijking, met een R 2 = 0,41) is weergegeven als een lijn.
Aanvullende Figuur 1. LF Pol I-bevattende Pol I plasmide. Een Sequence (FASTA formaat). Sequentie-informatie voor het bepalen van de juiste restrictie-enzym (s) moet worden gebruikt wanneer lineariseringsschakelingen van de Pol ik plasmide ofwel voor iteratie (genereren van een willekeurige mutatie bibliotheek stap 4) of de uitlezing (stap 5). B Algemene eigenschappen en beperkingen kaart van het plasmide. De locatie van het pSC101 oorsprong van replicatie, de chloramfenicol weerstand marker (CAT) en de LF-Pol I gen worden gepresenteerd. De locatie van enkele restrictieplaatsen wordt aangegeven als goed.
| Bibliotheek | Direct Plating | Vloeistof (1 dag) | Vloeistof (3 dagen) | |
| Mutaties (#) | 95 | 40 | 142 | |
| Klonen volgorde | 288 | 96 | 190 | |
| Totaal Dekking (bp) | 182.000 | 102.000 | 213.000 | |
| Mutatie freq (x10 3 bp) | 0.52 | 0.39 | 0.67 | |
| Freq d <1000 (x10 3 bp) | 0.92 | 0.41 | 0.70 |
Tabel 1. Mutatie frequenties Frequenties (uitgedrukt als # van mutaties / bp) voor d <1000, dus binnen de 1000 bp grenzend aan het RNA / DNA-schakelaar, voor drie mutagenese protocollen:. Direct plating, vloeibaar verzadiging (1 dag), en vloeibare hypersaturation ( 3 dagen).
| Direct Plating | Vloeistof | ||
| Mutaties (#) | 95 | 182 | |
| Spectrum (%) | |||
| A tot G | A tot G | 6.3 | 19,2 |
| T naar C | 4.2 | 3.8 | |
| C tot T | G naar A | 27,4 | 13,7 |
| C tot T | 35,8 | 35,2 | |
| A naar T | A naar T | 5.3 | 8.2 |
| T naar A | 5.3 | 7.1 | |
| T tot en met G | T tot en met G | 1.1 | 1.1 |
| A naar C | 0.0 | 2.2 | |
| G naar T | G naar T | 1.1 | 2.7 |
| C naar A | 2.1 | 2.7 | |
| C tot G | C tot G | 2.1 | 1.1 |
| G naar C | 5.3 | 2.7 | |
| Indels | Ins | 3.2 | 0.0 |
| Del | 1.1 | 0.0 | |
| A naar N | 11,6 | 29,7 | |
| G tot N | 33,7 | 19,2 | |
| T naar N | 10,5 | 12,1 | |
| C tot N | 40,0 | 39,0 | |
| Ts | 73,7 | 72,0 | |
| TV | 22,1 | 28,0 | |
| Indels | 4.2 | 0 |
Tabel 2. Metrics van de mutatie voor directe plating en vloeibare mutagenese. De tabel geeft het aantal waargenomen mutaties (in aantal) en de mutatie spectrum (in%) na een enkele cyclus van mutagenese. Het spectrum wordt afgebroken door complementaire paren, door nucleotide veranderingen, en door het type van de mutatie.
Discussion
Dit artikel presenteert een mutagenese protocol dat de generatie van grote willekeurige mutant bibliotheken mogelijk maakt zonder de noodzaak voor het klonen of PCR. Deze methode is gebaseerd op foutgevoelig replicatie van een plasmide dat codeert voor een sequentie van interesse. In theorie, mutaties moeten grotendeels worden beperkt tot de 100-300 bp onmiddellijk stroomafwaarts van het RNA / DNA-schakelaar, de grootte van de leider streng intermediaire geproduceerd door Pol I 2,10. We vonden dat onder de voorwaarden die in dit protocol, Pol ik mutaties optreden overal in het plasmide, hoewel kleiner in frequentie als de afstand van het plasmide ori toeneemt (figuur 3). Deze bevinding impliceert dat de overgang of "switch" van Pol I tot en Pol III tijdens ColE1 plasmide replicatie is veel geleidelijker dan eerder gemeld, in ieder geval onder onze experimentele omstandigheden 2, en stemt in met eerdere studies suggereren een functionele redundantie tussen Pol I en Pol III 11.
Onze originele protocol beschreven mutagenese in vloeibare culturen (4). Dit protocol geeft 0,41 mutaties / kb voor d <1000, dus binnen de 1000 bp grenzend aan het RNA / DNA-schakelaar (tabel 1). Hypersaturation door het verlaten van de vloeistof cultuur in de shaker voor de drie dagen zonder de toevoeging van elke nieuwe media verhoogt de mutatie frequentie tot 0,70 mutaties / kb, maar resulteert in een zeer slechte plasmide rendement (minder dan 1% ten opzichte van dag 1; gegevens niet getoond) ( tabel 1). Hier presenteren wij een vereenvoudigde protocol gebaseerd op direct beplating de transformatie van het doel plasmide op vaste agar bij 37 ° C (Figuur 1). Deze procedure levert de grootste frequentie van de mutatie / cyclus van mutagenese (0,92 mutaties / kb voor d <1000) en aanzienlijk vergemakkelijkt iteratie. Veranderende cultuur voorwaarden aan vaste media ook invloed op de mutatie spectrum (tabel 2). Direct plating mutagenese vermindert de gemarkeerde asymmetrie tussen complementaire basenparen substituties gezien in vloeibare cultuur (vergelijk C → T vs G → A en A → G vs T → C). Aan de andere kant, direct plating produceerde meer indels (van minder dan 0,5% tot 4%) en verminderde het aantal A → G mutaties door 3-voudig, wat leidt tot een oververtegenwoordiging van G / C mutaties (74%). Over het algemeen zijn wij van mening dat de grotere eenvoud en een verhoogde efficiëntie van de directe beplating protocol hier gepresenteerde de voordelen van de iets meer evenwichtige mutatie spectrum geproduceerd door vloeibare mutagenese opweegt tegen.
Binnen de doelgroep plasmide, worden de mutaties gegenereerd door onze methode beperkt zich niet tot de gewenste doelsequentie. Toch moet de evolutie van nieuwe biochemische activiteiten afhankelijk zijn van mutaties in de target-gen, omdat dit een kwalitatieve dan een kwantitatieve verandering. Zo, het combineren van onze plasmide mutagenese met screening van mutanten op verloop platen speelt in op de sterke punten van ons systeem (grote bibliotheken en beschikbaarheid van selectie) voor de evolutie van nieuwe biochemische eigenschappen. Andere toepassingen van random mutagenese, zoals het optimaliseren van bestaande enzymatische activiteiten of randomiseren specifieke gebieden van een gen vereisen klonen volgt willekeurige mutagenese. In dit geval kan de bibliotheek in een plasmide, in tegenstelling tot een PCR-amplificatie product verbetert de efficiëntie van het klonen door het faciliteren van versterking en beperking.
Kortom, we zien een eenvoudig protocol om een willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde target-gen, dat opvalt door zijn eenvoud en voor de diversiteit van de gegenereerde bibliotheken. Laten we zien hoe deze methode kan worden gekoppeld met functionele selecties voor de efficiënte ontwikkeling van nieuwe biochemische activiteiten. Daarnaast kunnen onze in vivo gegenereerde bibliotheken gemakkelijk gekloond, waardoor plaats-specifieke mutagenese of optimalisatie van bestaande activiteiten.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door K08 award CA116429-04 aan MC en door een subsidie van de Conquer Cancer Now (concern) Stichting # 8501
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| carbenicillin | Cellgro | 46100R6 | 0.1mg/ml final |
| tetracycline | Fisher Scientific | BP7640 | 0.05mg/ml final |
| chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final |
| LB Agar Miller | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB Broth Miller | Difco Laboratories | 244620 | |
| Soft Agar | Difco Laboratories | 214580 | Made in house |
| Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A38401-1 | |
| Antifoam B emulsion | Sigma-Aldrich | A5757 | |
| Glycerol | Acros Organics | 332030025 | |
| 100x100x15mm sq dish | Fisher Scientific | 0875711A | |
| 100mm rnd dish | Fisher Scientific | 0875712A | |
| Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| 2mm gap tubes | Molecular BioProducts | 5520 | |
| Zippy mini prep kit | Zymo Research Corp. | D4020 |
References
- Camps, M. Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression. Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).
- Itoh, T., Tomizawa, J. Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).
- Polisky, B. ColE1 replication control circuitry: sense from antisense. Cell. 55, 929-932 (1988).
- Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).
- Shinkai, A., Loeb, L. A. In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection. J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).
- Uyemura, D., Lehman, I. R. Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation. J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).
- Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases. Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).
- Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S.
- Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).
- Itoh, T., Tomizawa, J. FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).
- Bryan, S. K., Moses, R. E. Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees. C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).
