Summary
Här visar vi ett enkelt protokoll för att skapa en slumpmässig mutant bibliotek för ett givet mål sekvens. Vi visar hur denna metod, som sker in vivo i Escherichia coli, kan kopplas till funktionella val att utveckla nya enzymaktiviteten.
Abstract
Den effektiva generationen av genetisk mångfald är ett ovärderligt molekylära verktyg som kan användas för att märka DNA-syntes, för att skapa unika molekylära signaturer, eller att utvecklas proteiner i laboratoriet. Här presenterar vi ett protokoll som gör att uppkomsten av stora (> 10 11) mutant bibliotek för ett givet mål sekvens. Denna metod är baserad på replikering av en ColE1 plasmid som kodar för önskad sekvens av en låg-fidelity variant av DNA-polymeras I (LF-Pol I). Målet plasmid förvandlas till en Mutator stam av E. coli och pläterade på fasta medier, vilket ger mellan 0,2 och 1 mutationer / kb, beroende på var målgenen. Högre mutation frekvenser uppnås genom iteration denna process av mutagenes. Jämfört med alternativa metoder för mutagenes, står våra protokoll ut för sin enkelhet, eftersom ingen kloning eller PCR är inblandade. Således är vår metod idealisk för mutationsstatus märkning av plasmider eller andra Pol mallar jag eller att utforska stora delar av sekvensen utrymme för utvecklingen av verksamheter som inte finns i det ursprungliga målet. Den snäva rumsliga kontroll som PCR eller randomiserad oligonukleotid-baserade metoder erbjuder också kan uppnås genom efterföljande kloning av specifika delar av biblioteket. Här ger vi protokoll visar hur du skapar en slumpmässig mutant bibliotek och hur man kan upprätta drog-baserade val i E. coli för att identifiera mutanter uppvisar nya biokemiska aktiviteter.
Protocol
I. generationen av en slumpmässig Mutant bibliotek
Pol Jag förmedlar inleds ColE1 plasmid-replikering (över i (1-3). Vår metod för mutagenes är baserad på att placera en målsekvens i en ColE1 plasmid anslutning till ursprung eller replikering och sprida den i celler som uttrycker låg-fidelity DNA-polymeras I (LF-Pol I). LF-Pol jag är en mutant DNA-polymeras Jag kodning tre mutationer som minskar trohet replikering, nämligen I709N (i motivet A), A759R (i motiv B) och D424A (inaktiverande korrekturläsning) 4,5 . LF-Pol jag är uttryckt i en E. coli-stam, JS200, som har en temperatur-känsliga allelen av Pol I (polA12) (6) så att LF-Pol jag blir den dominerande verksamheten vid 37 ° C. replikering av målsekvens i polA12 celler under restriktiva villkor resulterar i uppkomsten av en slumpmässig mutant bibliotek. Mutagenicitet är mer effektivt i mättade kulturer 4. Av skäl som fortfarande är oklara, är mutagenes inte kontinuerlig, dvs mutationsfrekvensen ökar inte linjärt med antalet generationer när kulturen når mättnad, även om celler tillåts att expandera ytterligare i färsk media. därför att ytterligare öka mutationen belastningen av biblioteket krävs iterativa rundor av mutagenes och plasmid återhämtning. Här ger vi protokoll för LF-Pol jag mutagenes. Observera att de protokoll som presenteras här avsevärt har förenklats i förhållande till vår ursprungliga beskrivning 4 för att underlätta iteration i processen för att uppnå den önskade mutationen belastningen (Fig. 1).
Material
- Celler: JS200 recA718 polA12 (TS) uvrA155 trpE65 LON-11 sula
- JS200 WT-Pol I: JS200 celler som uttrycker vild typ (WT) Pol jag
- JS200 LF-Pol I: JS200 uttrycka låg fidelity (LF) Pol jag
- Avläsning stam: JS200 WT-Pol I eller (för komplettering) en stam som saknar en specifik verksamhet
- Mål Plasmid
- Plasmid som innehåller en ColE1 ursprung replikering med målgenen klonade i
1. Innan Mutagenicitet: Förberedelse av elektro-behöriga JS200 LF-Pol Jag celler
- Välj en enda JS200 LF-Pol jag koloni från en LB tallrik växt vid 30 ° C (begränsande villkor) över natten som innehåller lämpliga antibiotika uttagningen till plasmiden med LF-Pol I (0.03mg / ml kloramfenikol) och placera kolonin i ett test tub innehåller 8 ml LB med kloramfenikol. Odla kulturen vid 30 ° C och skaka på 250rpm över natten.
- På morgonen expandera kulturen genom att hälla den 8 ml JS200 LF-Pol jag i en kolv som innehåller 400 ml LB med kloramfenikol. Låt kulturen växa i 30 ° C under omskakning vid 250rpm tills den når en A 600 på 0,4 till 0,7 (vanligtvis 3-4h).
- Väl framme vid en A 600 av 0,4-0,7, kyla kulturen på våt is i 15 minuter.
- Överför kylda kulturen till en lämplig behållare för centrifugering. Pellets cellerna genom centrifugering vid 4 ° C. Häll av supernatanten och tillsätt sedan 10 ml av steril och kylda (på is) 10% glycerol till behållaren och återsuspendera cellerna med hjälp av en serologisk pipett.
- Överför resuspenderas celler i ett 50 ml koniskt rör. Fyll koniska röret upp till 45 ml märket med 10% glycerol och centrifugera sedan i 15 minuter vid 4 ° C och 4000rpm.
- Häll av supernatanten, lägga ännu en gång 10 ml 10% glycerol till det koniska röret, och återsuspendera cellerna med hjälp av ett serologiskt eller normal pipett. Återigen, fylla upp den koniska röret till 45 ml märket med 10% glycerol och centrifugera i 15 minuter vid 4 ° C och 4000rpm. Upprepa denna procedur två gånger till för att avlägsna alla spår av salter.
- Efter den sista centrifugeringen, återsuspendera pellet av cellerna i lika delar 10% glycerol (dvs. återsuspendera 2 mL av celler med 2 ml 10% glycerol).
- Alikvotera mellan 100 mikroliter och 500 mikroliter av suspenderade cellerna i flera lager rör. Quick-frysa celler på torr is och sedan lagra dem på -80 ° C.
- Innan du använder celler för elektro-behörig transformationer, tina cellerna långsamt på is.
2. Mutagenes: Transforming målet plasmiden
- Pipettera 40 ìl av elektro-behöriga JS200 LF-Pol Jag celler och mellan 30-250ng av målet plasmid-DNA till en 2mm gap elektroporation kyvett.
Note # 1: En ColE1 plasmid som innehåller GFP kan genomföras mutagenes parallellt med målgenen som en kontroll. Efter avslutad avläsning steg, kan GFP beläggas på tallrikar LB agar och visualiseras för mutagenes. Kolonier som mörka eller dimma innehåller inaktivera mutationer. - Puls blandningen i electroporator vid 1800V. Kontrollera tidskonstant (T C) att säkerställa enhetliga elektroporation förutsättningar för varje prov, helst T C = 5-6 sek.
- Återställa cellen / DNA blandningen i 1 ml LB buljong i 40 minuter vid 37 ° C (restrictive villkor) skaka vid 250 rpm.
- Plate 50 mikroliter av återhämtningen kultur på en 100mm LB agar petriskål förvärmas till 37 ° C som innehåller både kloramfenikol och en lämplig koncentration av ett antibiotikum välja för målet plasmiden.
Obs: # 2: Sikta på att plattan cellerna på en "nära gräsmattan" koncentration. En "nära gräsmattan" koncentration definieras som en distinkt, men oräkneliga antal kolonier (> 1000 kolonier / 100mm maträtt). Utspädningen pläterade, om någon, beror på hur elektromagnetiska behöriga cellerna. Om cellerna inte är särskilt elektro-kompetent och en "nära gräsmattan" inte kan uppnås genom bordläggning återhämtningen kultur "snyggt" och sedan centrifugera återhämtningen kulturen i 2 minuter vid 4000rpm, häll bort supernatanten, återsuspendera cellerna i 50 mikroliter av LB buljong och platta kulturen. - Inkubera Petri dishe (s) över natten vid 37 ° C.
3. Mutagenicitet: Plasmid återhämtning
- Nästa dag, tvätta de petriskålar genom att pipettera 2 ml LB buljongen över cellerna. Överför kolonier från Petri LB agar rätter till LB spadet av "skrubba" bort dem från plattan med en steriliserad triangelformad glasstav. Tillsätt 1 ml LB buljong först samla tvätta och upprepa proceduren med den andra mL LB buljong.
- Isolera plasmid DNA från plattan tvätt. (Denna plasmid-DNA utgör biblioteket).
Note # 3: tvätta samlats in från LB plattan kan vara för tät för att mini-prep i sin helhet. Om så är fallet, mini-prep maximalt tilldelade beloppet av din mini-prep kit (vanligtvis inblandade denna späda din tvätt till OD = 1 och prepping ~ 3 ml av den utspädda kultur) eller skala upp till ett maxi-prep
4. Iteration
- Begränsa 1μg av de isolerade plasmid-DNA med en begränsning enzym som linearizes LF-Pol jag plasmid, men inte klippa din målgrupp plasmid (kompletterande Fig. 1).
- Städa upp begränsningen smälta med hjälp av ett kit DNA-rening.
Note # 4: Detta steg tar bort alla spår av begränsningen enzymet och dess buffert. Detta steg är viktigt att hålla saltkoncentrationen låga för efterföljande elektro-behörig transformationer. - Re-omvandla 30-250ng av de begränsade mål-plasmid-bibliotek tillbaka in färska JS200 LF-Pol Jag celler att sätta i biblioteket genom efterföljande omgångar mutagenes.
Note # 5: Linearizing Pol jag plasmiden med hjälp av en restriktionsenzymanalys ser bara målet plasmiden blir förvandlade. - Upprepa avsnitt 2 och 3.
5. Avläsning
- Begränsa isolerade plasmid-DNA med en begränsning enzym (er) att linearizes både mål plasmiden och Pol jag plasmiden. Kör smälta på en 1% agarosgel att säkerställa kvantitet och kvalitet på plasmider. Begränsa ~ 400ng av de isolerade plasmid-DNA är vanligen tillräcklig för analys.
- Begränsa 1μg av de isolerade plasmid-DNA med en begränsning enzym som linearizes LF-Pol jag plasmid, men inte klippa din målgrupp plasmid.
- Städa upp begränsningen smälta med hjälp av ett kit DNA-rening.
- Omvandla den begränsade målet plasmiden biblioteket till en avläsning stam att karakterisera mutationer.
II. Mutant Screen och Trait analys med hjälp av skyltar Gradient tillväxt.
För att illustrera hur den stora genetiska mångfalden som finns i våra bibliotek kan kopplas till en funktionell urval, här erbjuder vi ett protokoll för drog-baserade funktionella val in vivo i E. coli. Denna metod bygger på tillväxt längs en drog lutning på fast agar. Detta gör att samtidig karakterisering av flera (upp till 12) prover över en rad koncentrationer, vilket ger ett större dynamiskt omfång än en enda läkemedelsbehandling. En annan fördel är att den icke-linjära avläsning av detta test buffertar måttliga skillnader i lönsamheten inom en 2-faldig sortiment. Således ger denna cytotoxicitet-motstånd analysen en robust och snabb möjlighet att välja mutant bibliotek och för att bestämma fenotypiska profil enskilda mutanter. Fig.. 2 visar ett exempel på vart och ett av dessa användningsområden: Panelen A visar urval av enskilda mutanter från en mänsklig oxidativa demetylas ABH2 bibliotek. Kolonierna växer ovanför WT tröskeln väljs för ökat skydd mot cytotoxicitet orsakas av methylating agenten metyl metan sulfonat (MMS) 7. Panel B visar ett exempel på gradienter som används för individuella klon karakterisering. Nivån av resistens mot tredje generationens cefalosporinantibiotikum cefotaxim visas på en agar lutning för WT β-laktamas och för två bredspektrum mutanter, R164H och E104K R164S G267R 4. Observera att beroende på styrkan i de observerade effekterna, mer än en enda skylt kan vara nödvändig för adekvat kvantifiering: medan 0.4mg/ml lutning möjliggör direkt jämförelse med kontrollgruppen kloner, graden av motstånd av de mest potenta mutant kan bara fastställas med hjälp av en högre koncentrationkoncentration av cefotaxim (4mg/mL).
Material
- Utrustning
- 100x100x15mm torget petriskålar (Fisher Sci # 0875711A)
- 100mm rund petriskål
- 25x75x1mm glas objektglas (Fischer Sci # 1.255.015)
- 50 ml tub examen
- Media
- LB agar: smält och jämvikt i ett vattenbad vid 56 ° C
Note # 6: Temperaturen i media kan påverka stabiliteten och därmed aktiviteten av läkemedlet eller sammansatta att undersökas. - Mjuk agar: smält och jämvikt i ett vattenbad till 42 ° C
- LB agar: smält och jämvikt i ett vattenbad vid 56 ° C
1. Byggandet av gradienten
- Mark tio banor, fördelade jämnt över en kant längst ner på torget petriskål.
- Placera skålen på en sluttning så att den nedre markerade kanten är förhöjd 7mm;
ett tjockt gräs eller annat platt föremål kan användas som stöd för att lyfta skålen. Häll 25 ml varmt (~ 56 ° C) LB agar blandas väl med en lämplig koncentration av välja agenten i lutande skålen. Detta är den nedersta lagret av övertoningen. Se till att LB agar jämnt rockar petriskål så att förhöjda, markerade slutet av skålen innehåller ~ 1 mm i LB agar och sänkt delen innehåller ~ 8mm i LB agar. Låt sedan agar för att ställa i 10-15 minuter.
Note # 7: För hydrofoba val av ombud, får 0,1% tensid (antiskummedel B emulsion) läggas till i LB agar för att underlätta upphängning och jämn fördelning av läkemedlet. Lägg tensid till det varma sterilt LB-agar med kraftig skakning före tillägg av val av agent. Tensiden bör skjuta som en fin dimma av små droppar, stora droppar ange media är för varmt och kan hämma jämn fördelning av testet drogen. - Efter de första 25 ml LB agar har härdat är skålen flyttas till en plan yta. Därefter är 25 ml LB agar utan att välja agenten strömmade till overlay den första ytan LB agar. Detta är det översta lagret av övertoningen. Se till att LB agar täcker hela ytan av bottenskiktet. Täck med lock snett för ventilation, och låta agar för att ställa i 10-15 minuter.
Note # 8: Var medveten om aerosol faror och möjligheter avdunstning av test-föreningen, häll övertoningar i en kemisk eller biologisk säkerhet huva om ordinerats av kemiska säkerhetskraven.
Note # 9: Gradient rätter bör användas inom 4 timmar för att bevara lutning av drogen eller testsubstansen koncentration.
2. Stämpel överföring av bakterier
- Mjuka agar ska vara utjämnat till 42 ° C. Överföring 2 ml vätska mjuka agar i locket eller botten av en 100mm rund petriskål. Pipettera 40 ìl av bakteriekultur i den mjuka agar och blanda med gungande plattan.
Note # 10: tillväxtfas av en bakteriekultur kan påverka sitt svar på en drog eller testa förening. Kulturer i loggen fas eller över natten kulturer i stationär fas bör användas med konsekvens för enhetliga resultat. Celltäthet också kan skeva relativa resultat, vilket alla kulturer bör spädas ha matchas A 600 densitetsvärden. Övernattning kulturer bör spädas för att ha en A 600 densitet mindre än 1,0 - Coat långsidan av glaset objektglas med den mjuka agar blandningen. Sedan anpassa den belagda kanten av bilden med botten märket (från låg till hög koncentration) på lutning skålen, rör vid bilden för att ytan på agar. En mjuk beröring är tillräckligt för att överföra ett band av mjuk agar till lutning ytan. Bilden är sedan avsatt för rengöring och återanvändning.
- Upprepa denna process, för återstoden av den bakteriella prover. Referensprover bör inkluderas på varje gradient maträtt om flera gradienter drivs.
- Inkubera toppen gradienten maträtt ner över natten vid 37 ° C. Tider och temperaturer på inkubationstiden kan vara olika för olika avläsning bakteriestammar, men över natten vid 37 ° C är normalt tillräckligt för synlig tillväxt.
3. Imaging och analysera tillväxt
- Imaging: Efter övernattning tillväxt, kan lutningar direkt avbildas eller fast och färgas med en lösning av 0,2 mg / ml akridinorange i 95% EtOH, för att öka kontrasten. Plattan inkuberas i rumstemperatur i 5 min, färgningslösningen och sedan tvättas med 95% EtOH och sedan avbildas under en UV-ljuslåda.
Note # 11: Se till att inte spola kolonier från plattan utan sten färglösningen och sköljer över plattan och ta bort lösningar från hörnen. - För fenotyp analys av enskilda mutant plasmider, är avståndet till tillväxt mot koncentrationsgradient normaliserat till en standard på varje gradient. Dessa relativa värden kan sedan jämföras mellan lutningar.
Note # 12: Beroende på typ av cytotoxiska effekt, kan en skarp kant eller en mer diffus kant observeras (jämför till exempel paneler A och B i Fig. 2). När det gäller diffusa kanter, är det lämpligt att mäta kanten of kontinuerlig tillväxt, som enskilda kolonier tenderar att visa ökad variabilitet. - För biblioteket urval, är enskilda kolonier som växer vid koncentrationer högre än föräldrarnas vildtyp kontroll isolerad och sekvenseras för att identifiera mutationer som bidrar till ökat skydd.
III. Representativa resultat:
Figur 1. Jämförelse mellan vätska och direkt protokoll plätering mutagenes. Direkta plätering mutagenes protokoll presenteras här (botten) är snabbare och kräver färre steg än vårt ursprungliga flytande mutagenes protokoll (överst). När GFP används som en reporter, variationer i fluorescens vittnar om den genetiska mångfalden som finns i biblioteket. Vanligtvis en cykel av mutagenes resulterar i 12-18% kolonier med avsevärt minskade nivåer av fluorescens.
Figur 2. Gradient motstånd analyser. Panel A Urval för ökad resistens mot Metyl-methanesulfonate (MMS). Plasmid bibliotek av den mänskliga oxidativa demetylas ABH2 valdes ut för ökat motstånd till MMS. Två sådana bibliotek som representerar två och fyra iterationer av mutagenes-protokollet visas i förhållande till föräldrarnas vildtypen (WT) och den tomma vektorn (Δ). Den vita linje markerar den tröskel över vilken enskild mutant kolonier isolerades för vidare fenotypisk analys. Panel B Cefotaxim skydd, ett tecken på utvidgat spektrum β-laktamas aktivitet. R164H och E104K R164H G267R, två mutanter av beta-laktamas tidigare identifierats efter LF- Pol Jag mutagenes kopplad till aztreonam val 4, visas på en 0.4μg/mL och en 4μg/mL cefotaxim lutning. Observera att vildtyp β-laktamas enzymet ger inget skydd i förhållande till celler som uttrycker en tom vektor, Δ. Därför är dessa mutanter representerar utvecklingen av en ny biokemiska aktivitet 8,9.
Figur 3. Mutationsfrekvensen som funktion av avstånd från Ori (D). Mutationsfrekvensen efter en cykel direkt plätering mutagenes visas för 100 bp intervall i förhållande till RNA / DNA-switch för ColE1 ursprung replikering. Området mellan 1600 och 2400 är inte representerade eftersom β-laktamas inte utgör en neutral mål. De punkter bortom β-laktamas representerar 200 bp intervall den allmänt låga frekvensen av mutation i detta område. Trenden (binomial ekvation med ett R 2 = 0,41) visas som en linje.
Kompletterande figur 1. LF Pol I-innehållande Pol jag plasmid. En sekvens (Fasta-format). Sekvens information för fastställande av lämplig begränsning enzym (er) som ska användas när linearizing Pol jag plasmiden antingen för iteration (generering av en slumpmässig mutation bibliotek steg 4) eller avläsningen (steg 5). B Allmänna egenskaper och begränsningar karta av plasmiden. Den Placeringen av pSC101 ursprung replikering och kloramfenikolacetyltransferasgenen motståndet markör (CAT) och LF-Pol jag gen presenteras. Placeringen av enstaka begränsning webbplatser visas också.
| Bibliotek | Direkt Plating | Flytande (1 dag) | Flytande (3 dagar) | |
| Mutationer (#) | 95 | 40 | 142 | |
| Kloner sekvenseras | 288 | 96 | 190 | |
| Total täckning (BP) | 182 tusen | 102 tusen | 213 tusen | |
| Mutation frekv (x10 3 bp) | 0,52 | 0,39 | 0,67 | |
| Freq D <1000 (x10 3 bp) | 0,92 | 0,41 | 0,70 |
Tabell 1. Mutation frekvenser frekvenser (uttryckt som # av mutationer / BP) för D <1000, dvs inom 1000 bp i anslutning till RNA / DNA-switch, tre mutagenes protokoll:. Direkta plätering, flytande mättnad (1 dag), och flytande hypersaturation ( 3 dagar).
| Direkt Plating | Flytande | ||
| Mutationer (#) | 95 | 182 | |
| Spectrum (%) | |||
| A till G | A till G | 6,3 | 19,2 |
| T till C | 4,2 | 3,8 | |
| C till T | G till A | 27,4 | 13,7 |
| C till T | 35,8 | 35,2 | |
| A till T | A till T | 5,3 | 8,2 |
| T till A | 5,3 | 7,1 | |
| T till G | T till G | 1,1 | 1,1 |
| A till C | 0,0 | 2,2 | |
| G till T | G till T | 1,1 | 2,7 |
| C till A | 2,1 | 2,7 | |
| C-G | C-G | 2,1 | 1,1 |
| G till C | 5,3 | 2,7 | |
| Indels | Ins | 3,2 | 0,0 |
| Del | 1,1 | 0,0 | |
| A till N | 11,6 | 29,7 | |
| G till N | 33,7 | 19,2 | |
| T till N | 10,5 | 12,1 | |
| C-N | 40,0 | 39,0 | |
| Ts | 73,7 | 72,0 | |
| TV | 22,1 | 28,0 | |
| Indels | 4,2 | 0 |
Tabell 2. Metrics av mutation för direkt plätering och flytande mutagenes. I tabellen redovisas antalet observerade mutationer (i antal) och mutationen spektrum (i%) efter en cykel av mutagenes. Det spektrum bryts ner av kompletterande par av nukleotid förändringar, och av den typ av mutation.
Discussion
Den här artikeln presenteras en mutagenes protokoll som gör att den generation av stora slumpmässiga mutant bibliotek utan behov av kloning eller PCR. Denna metod är baserad på felbenägen replikering av en plasmid koda en sekvens av intresse. I teorin bör mutationer i stort sett begränsas till 100-300 bp belägen omedelbart nedströms RNA / DNA-switch, producerade storleken på ledaren tråd mellanliggande av Pol jag 2,10. Vi fann att på de villkor som presenteras i detta protokoll, Pol jag mutationer uppstår hela plasmiden, men minskar i frekvens som avståndet från plasmiden Ori ökar (Figur 3). Detta fynd innebär att övergången eller "switch" från Pol jag Pol III under ColE1 plasmiden replikering är mycket mer gradvis än vad som tidigare rapporterats, åtminstone enligt våra experimentella villkor 2, och håller med tidigare studier tyder på en funktionell redundans mellan Pol I och Pol III 11.
Vår ursprungliga protokoll som beskrivs mutagenes i flytande kulturer (4). Detta protokoll ger 0,41 mutationer / KB för d <1000, dvs inom 1000 bp i anslutning till RNA / DNA-switch (tabell 1). Hypersaturation genom att låta vätskan kulturen i shakern i 3 dagar utan tillsats av något nytt media höjer mutationsfrekvensen till 0,70 mutationer / kb men resulterar i mycket dåligt plasmid avkastning (mindre än 1% jämfört med dag 1, data visas inte) ( Tabell 1). Här presenterar vi en förenklad protokoll baseras på direkt plätering omvandlingen av målet plasmiden på fast agar vid 37 ° C (figur 1). Detta förfarande ger den största frekvensen av mutationer / cykel mutagenes (0,92 mutationer / KB för d <1000) och avsevärt underlättar iteration. Byta kulturen förutsättningar att fasta medier påverkar också mutationen spektrum (tabell 2). Direkt bordläggning mutagenes minskar markant asymmetri mellan kompletterande basparsubstitutioner sett i flytande kultur (jämför C → T vs G → A och A → G vs T → C). Å andra sidan, producerade direkt plattspridning mer indels (från mindre än 0,5% till 4%) och minskade antalet A → G mutationer med 3-faldigt, vilket leder till en överrepresentation av G / C mutationer (74%). Sammantaget tror vi att en större enkelhet och ökad effektivitet av den direkta bordläggning protokollet presenteras här överväger fördelarna med den något mer balanserad mutation spektrum produceras av flytande mutagenes.
Inom målet plasmiden, är mutationer genereras av vår metod inte begränsat till önskad målsekvens. Bör dock utvecklingen av nya biokemiska aktiviteter att vara beroende av mutationer inom målgenen, eftersom det utgör en kvalitativ snarare än en kvantitativ förändring. Således kombinera våra plasmid mutagenes genomgången av mutanter på lutning tallrikar kapitaliserar på styrkan i vårt system (stora bibliotek och tillgänglighet urval) för utvecklingen av nya biokemiska egenskaper. Andra tillämpningar av slumpmässig mutagenes exempelvis optimera befintliga enzymatiska aktiviteter eller randomisera specifika områden i en gen kräver kloning efter slumpmässig mutagenes. I detta fall, efter att ha biblioteket i en plasmid i motsats till en PCR-amplifiering produkt förbättrar effektiviteten i kloning genom att underlätta förstärkning och begränsning.
Sammanfattningsvis visar vi ett enkelt protokoll för att skapa en slumpmässig mutant bibliotek för ett givet mål gen som utmärker sig för sin enkelhet och för mångfalden i den genererade bibliotek. Vi visar hur denna metod kan kopplas till funktionella alternativ för en effektiv utveckling av nya biokemiska aktiviteter. Dessutom kan våra in vivo-genererade biblioteken enkelt klonas, så att platsspecifika mutagenes eller optimering av befintlig verksamhet.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har stötts av K08 utmärkelse CA116429-04 till MC och genom ett bidrag från Conquer Cancer nu (ORO) stiftelsen # 8501
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| carbenicillin | Cellgro | 46100R6 | 0.1mg/ml final |
| tetracycline | Fisher Scientific | BP7640 | 0.05mg/ml final |
| chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final |
| LB Agar Miller | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB Broth Miller | Difco Laboratories | 244620 | |
| Soft Agar | Difco Laboratories | 214580 | Made in house |
| Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A38401-1 | |
| Antifoam B emulsion | Sigma-Aldrich | A5757 | |
| Glycerol | Acros Organics | 332030025 | |
| 100x100x15mm sq dish | Fisher Scientific | 0875711A | |
| 100mm rnd dish | Fisher Scientific | 0875712A | |
| Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| 2mm gap tubes | Molecular BioProducts | 5520 | |
| Zippy mini prep kit | Zymo Research Corp. | D4020 |
References
- Camps, M. Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression. Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).
- Itoh, T., Tomizawa, J. Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).
- Polisky, B. ColE1 replication control circuitry: sense from antisense. Cell. 55, 929-932 (1988).
- Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).
- Shinkai, A., Loeb, L. A. In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection. J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).
- Uyemura, D., Lehman, I. R. Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation. J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).
- Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases. Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).
- Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S.
- Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).
- Itoh, T., Tomizawa, J. FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).
- Bryan, S. K., Moses, R. E. Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees. C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).
