Une analyse boîte à outils de l'évaluation biochimique, structurel et transcriptomique globale des biofilms buccaux médiée par Streptococcus mutans
Summary
Les biofilms formés sur les surfaces dentaires sont très complexes et constamment exposés à innée et exogènes aux défis environnementaux, qui modulent leur architecture, la physiologie et du transcriptome. Nous avons développé une boîte à outils pour examiner la composition, l'organisation structurelle et l'expression des gènes des biofilms buccaux, qui peut être adapté à d'autres domaines de la recherche biofilm.
Abstract
Les biofilms sont très dynamiques, les communautés organisées et structurées de cellules microbiennes empêtré dans une matrice extracellulaire de densité variable et de la composition 1, 2. En général, les biofilms se développent à partir d'attachement microbienne initiale sur une surface suivie de la formation des amas de cellules (ou microcolonies) et le développement et la stabilisation des microcolonies, qui se produisent dans une matrice complexe extracellulaire. La majorité des matrices exopolysaccharides biofilm port (EPS), et les biofilms dentaires ne font pas exception, surtout ceux associés à la maladie carieuse, qui sont principalement médiée par streptocoques mutants 3. Les EPS sont synthétisées par des microorganismes (S. mutans, un contributeur clé) au moyen d'enzymes extracellulaires, tels que le saccharose glucosyltransférases utilisant principalement comme substrat 3.
Les études sur les biofilms formés sur les surfaces dentaires sont particulièrement difficiles en raison de leur exposition constante aux défis environnementaux complexes associés à l'alimentation hôte microbienne interactions se produisant dans la cavité buccale. Une meilleure compréhension de l'évolution dynamique de l'organisation structurelle et de la composition de la matrice, la physiologie et du transcriptome / protéome le profil du biofilm-cellules en réponse à ces interactions complexes permettrait d'améliorer les connaissances actuelles sur la manière dont les biofilms buccaux modulent la pathogénicité. Par conséquent, nous avons développé une boîte à outils analytiques pour faciliter l'analyse de biofilm au niveau structurel, biochimique et moléculaire en combinant des techniques couramment disponibles et roman avec logiciel personnalisé pour l'analyse des données. Standard d'analyse (essais colorimétriques, RT-qPCR et les microarrays) et de nouvelles techniques de fluorescence (pour l'étiquetage simultanée des bactéries et des EPS) ont été intégrés à un logiciel spécifique pour l'analyse de données pour répondre à la nature complexe de la recherche biofilm orale.
La boîte à outils se compose de quatre étapes distinctes mais reliées entre elles (figure 1): 1) essais biologiques, 2) premières données d'entrée, 3) le traitement des données, et 4) l'analyse des données. Nous avons utilisé notre modèle in vitro de biofilm et les conditions expérimentales spécifiques pour démontrer l'utilité et la souplesse de la boîte à outils. Le modèle de biofilm est simple, reproductible et plusieurs répliques d'une expérience unique qui peut être fait simultanément 4, 5. En outre, elle permet une évaluation temporelle, l'inclusion d'espèces microbiennes différentes 5 et l'évaluation des effets des différentes conditions expérimentales (par exemple traitements 6; comparaison des mutants KO vs souche parentale 5, la disponibilité des glucides 7). Ici, nous décrivons deux composantes spécifiques de la boîte à outils, y compris (i) un nouveau logiciel pour l'exploration de données biopuces / organisation (MDV) et à l'analyse d'imagerie de fluorescence (DUOSTAT), et (ii) in situ EPS-étiquetage. Nous fournissons également un cas expérimental montrant comment la boîte à outils peuvent aider à l'analyse des biofilms, organisation des données, l'intégration et l'interprétation.
Protocol
Discussion
Dans cette présentation, nous avons démontré deux composantes essentielles de l'analyse Tool-Box (EPS / bactéries d'imagerie et de données de microréseaux minière / traitement), la polyvalence et l'utilité des différents essais intégrés dans le système. De toute évidence, la boîte à outils a facilité l'analyse complète (comparatif) et simultanée des différents aspects de la biochimie des biofilms, l'architecture et l'expression des gènes en réponse à différentes conditions …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Gary Xie et Herbert Lee pour le développement de la MDV. Nous remercions également les docteurs. Simone Duarte, Ramiro Murata, Jae-gyu Jeon, Abranches Jacqueline, et Mme Stacy Grégoire pour leur contribution technique et scientifique pour les composants analytiques de la boîte à outils. Cette étude a été soutenue en partie par USPHS subventions de recherche DE018023 de l'Institut national de recherche dentaire et craniofaciale.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | ||
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | ||
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | ||
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus, Tokyo, Japan |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Leme, P. a. e. s., Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. u. r. y. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation–new insight. J Dent Res. 85, 878-887 (2006).
- Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries. J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).
- Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).
- Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms. BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).
- Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development. PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).
- Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms. Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).
- Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol. J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).
- Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).
- Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development. Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).
- Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).
- Xiao, J., Koo, H. Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms. J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).
- Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).
- Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r., Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >., Crielaard, W. Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms. J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).
